MÜELLER HINTON AGAR: TEMEL, HAZIRLIK VE KULLANIMLAR - BIYOLOJI - 2025

Mueller Hinton Agar seçici, bir katı besin ortamı ağar, et infüzyon, pepton kazein, nişasta şeklinde ve su damıtılır değildir. Bu besiyeri, çoğu hızlı büyüyen bakteri için mükemmel mikrobiyal büyümeye izin verir.

Başlangıçta John Howard Müeller ve Jane Hinton tarafından Neisseria gonorrhoeae ve Neisseria meningitidis gibi beslenme açısından zorlu bakterileri izole etmek için yaratıldı. Bununla birlikte, özellikleri nedeniyle, antibiyotiklere duyarlılık çalışması için ideal olduğu, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağladığı ortaya çıktı.

Antibiyogramlar (Müeller Hinton agar). Kaynak: en.wikipedia'da Dr Graham Beards

Bu nedenle Müeller Hinton agar, Kirby disk difüzyon yöntemi ile antimikrobiyal duyarlılık testinin performansı için Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) ve Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi tarafından kabul edilen kültür besiyeridir ve Bauer.

temel

Seçici olmayan bir besleyici ortam olarak, çoğu patojenik bakterinin büyümesi için mükemmeldir.

Öte yandan, basit bileşimi, maddelerin üzerine kolayca dağılmasını sağlar, bu da disk difüzyon yöntemi ile duyarlılık testi için temel bir özelliktir.

Diğer bir özelliği de, sülfonamidler, trimetoprim ve tetrasiklinlerin etkili bir şekilde değerlendirilmesine izin veren düşük miktarda inhibitör içermesidir.

Bununla birlikte, ortamın düzgün çalışmasını sağlamak için aşağıdakiler dahil belirli koşulları karşılaması gerektiği unutulmamalıdır:

PH, agar derinliği ve uygun timin, timidin, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ ve Zn ⁺⁺ konsantrasyonunun ayarlanması .

Ayrıca metodolojinin standartlaştırıldığını ve bu nedenle aşağıdaki gibi tüm parametrelerin karşılanması gerektiğini bilmelisiniz:

İnokülum konsantrasyonu, antibiyotik disklerin konsantrasyonu ve muhafazası, uygun sayıda diskin agara yerleştirilmesi, bir disk ile diğeri arasındaki mesafe, belirli antibiyotiklerin stratejik yerleşimi, atmosfer, sıcaklık ve süre inkübasyon.

Hazırlık

37 g kurutulmuş Müeller Hinton besiyerini tartın ve 1 litre damıtılmış suda çözün. Çözünmeye yardımcı olmak için karıştırırken ortamı ısıtın. 1 dakika kaynatın.

121 ° C'de 15 dakika sterilize etmek için otoklavlayın. Otoklavdan çıkarırken, şişe soğuması için 50 ° C'deki bir su banyosuna yerleştirilmelidir. 25-30 ml steril 10 cm çapındaki Petri kaplarına dökün.

Plakalar ortalama 4 mm (ideal) kalınlığında olmalı, 3-5 mm aralığına izin verilmektedir.

Baz olarak Müeller Hinton agar kullanarak kanlı agar hazırlamak isteniyorsa, plakalara servis yapmadan önce% 5 steril ve defibrine kuzu kanı dökün.

Ortamın nihai pH'ı 7,2 ile 7,4 arasında olmalıdır.

Kullanana kadar bir buzdolabına yatırım yapın ve saklayın. Kullanmadan önce plakanın oda sıcaklığına gelmesine izin verin.

Hazırlanan besiyerinin rengi açık bejdir.

Uygulamalar

Hızlı büyüyen zorlu olmayan çoğu patojen için antibiyogram veya antibiyotik duyarlılık testi yapmak için kullanılır.

Agar kanla desteklenmişse, diğerleri arasında Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis gibi zorlu mikroorganizmaların antibiyogramını gerçekleştirmek için kullanılır. Ayrıca Legionella pneumophila'yı izole etmek için de kullanılmıştır.

Antibiyogram tekniği

Antibiyogram uygulamadan önce, 1.5 x 10 bir bakteri çözeltisi, eşdeğer ⁸ hücreler hazırlanmış olmalıdır .

Bunun için saf kültürün 3 ila 4 koloni alınır ve soya fasulyesi triptikaz et suyunda veya Müeller Hinton çorbasında asılır, 2 ila 6 saat inkübe edilir ve konsantrasyon, steril salin solüsyonu ile ayarlanır, Mac Farland standardı ile karşılaştırılır. % 0.5.

Mikroorganizma talep ediyorlarsa, koloniler doğrudan% 0,5 Mac Farland konsantrasyonuna kadar askıya alınabilir. Daha sonra, Müeller Hinton plakasına hazırlanan bakteri solüsyonu emdirilmiş bir çubukla tohumlanır.

Bunu yapmak için, çubuk solüsyona daldırılır ve ardından fazla sıvı tüpün duvarlarına bastırılarak çıkarılır. Hemen ardından sürüntü tüm yüzeyin üzerinden geçirilerek hiçbir yere dokunulmaz, ardından plaka hafifçe döndürülerek tekrar tohumlanır. İşlem 2 kez daha tekrarlanır.

10 dakika bekletin ve sonra antibiyotik diskleri steril bir pens ile yerleştirin ve aralarında 24 mm boşluk bırakın. Her diski agar üzerine yerleştirdikten sonra, iyi yapışmalarını sağlamak için her diski forseps ile hafifçe bastırın.

İşlem bittiğinde, plaka ters çevrilir ve aerobiosis içinde 35-37 ° C'de 16 ila 18 saat inkübe edilir. Zorlu bir mikroorganizma ise mikroaerofili haklı olabilir ve antibiyogram oksasilin diskleri içeriyorsa 24 saat sonra okunmalıdır.

Her bir hale çapını ölçmek için bir cetvel kullanılır. Sonuçlar mm cinsinden kaydedilmelidir. Daha sonra, elde edilen değerler, mevcut CLSI kılavuzu tarafından yayınlanan kesme noktaları tablolarıyla ilişkilendirilir.

İnhibisyon halo ölçümü. Kaynak: USCDCP, Pixnio.com

Durum ne olursa olsun hassas (S), orta (I) veya dirençli (R) olarak bildirin.

İzole edilen mikroorganizmaya ve ürettiği enfeksiyon türüne göre antibiyotikler seçilir.

Bazen fenotipik direnç kalıplarını ortaya çıkarmak için antibiyotiklerin stratejik yerleşimi akılda tutulmalıdır.

Müeller Hinton agarda stratejik disk yerleştirme

Enterobakteriler için klavulanik asit diski 3. ve 4. nesil sefalosporinlere karşı yerleştirilmelidir. Yumurta şeklindeki bir genişleme, suşun bir genişletilmiş spektrumlu beta-laktamaz (ESBL) üreticisi olduğunu gösterir. Bu, hastanın herhangi bir sefalosporin ile tedavi edilmemesi gerektiği anlamına gelir.

Bir Escherichia coli suşunda genişletilmiş spektrumlu beta-laktamaz (ESBL) üretiminin fenotipik ifadesi. Kaynak: Fotoğraf, yazar MSc tarafından çekilmiştir. Marielsa Gil

Staphylococcus'ta eritromisin veya azitromisin diskini klindamisin diskinin önüne yerleştirmek önemlidir (D-testi).

Eritromisinde dirençli bir halo ve klindamisin halosunda bir düzleşme, suşun suşla indüklenebilir klindamisin direncine (ICR) sahip olduğunu gösterir. Bu, bir klindamisin tedavisinin etkili olmayacağı anlamına gelir.

Enterobacteriaceae ve bazı fermente olmayan Gram-negatif çubuklarda indüklenebilir AMP C suşlarını aramak için tazobaktan seftazidim, sefoksitin veya piperasilin diskleri, 27 mm'lik bir mesafede bir imipenem diske karşı karşıya getirilir.

İmipeneme bakan disklerden birinde düzleştirilmiş bir hale, indüklenebilir AMP C'nin varlığını gösterir.

Yapıcı C-AMP araştırması için, 500 ug kloksasilin diski 25 mm mesafede seftazidim (30 ug) ve sefotaksim (30 ug) ile karşı karşıya getirilir. Sefalosporinlerin herhangi birinde genişlemiş bir hale, pozitifliği gösterir.

Kloksasilin diski, 18 mm mesafe ile fenil borik asit (400 µg) emdirilmiş 9 mm Whatman No. 6 filtre kağıdı diski ile de değiştirilebilir. Bir öncekiyle aynı şekilde yorumlanır.

Son olarak, özellikle Pseudomonas aeruginosa'da metalobetalaktamaz üretimini araştırmak için imipenem ve meropenem diskleri ile karşılaşan 10 µl etilendiaminetetraasetik asit (EDTA 750 µg) ve tiyoglikolik asit (SMA 300 µg) ile emprenye edilmiş bir disk kullanılır. 15 mm mesafede.

İmipenem veya meropenem halelerinin EDTA / SMA diskine doğru genişlemesi varsa test pozitiftir. Bu sonuç, değiştirilmiş Hodge testi ile doğrulanmalıdır.

Bu yöntem bir Escherichia coli ATCC 25922 suşunun Müeller Hinton plakasına aşılanmasından oluşur. Plakanın ortasına bir imipenem disk yerleştirilir ve ardından şüpheli P. aeruginosa suşu ile diskten çevreye bir çizgi yapılır. Plaka başına 4 adede kadar suş test edilebilir.

Çatlak çevresinde imipenem halesinin bir distorsiyon bölgesi varsa test pozitif olacaktır.

Hatalı sonuçların nedenleri

- Kötü korunmuş antibiyotik diskler yanlış direnç üretebilir. Örneğin, oksasilin diski sıcaklıktaki değişikliklere karşı çok savunmasızdır.

- Belirtilenin altındaki bir ortamın pH'ı (asidik), aminoglikozidler ve makrolidlerde daha küçük haleler (yanlış direnç riski) ve penisilin, tetrasiklin ve novobiosin'de daha büyük haleler (yanlış duyarlılık riski) oluşturur.

-PH, belirtilenin üzerinde (alkali) ise, yukarıda açıklanan etkiler tersine çevrilir.

-Yüksek timin ve timidin konsantrasyonlarına sahip ortam, sülfonamidlerin ve trimetoprimin inhibisyon halelerini önemli ölçüde azaltarak etkiye sahiptir.

-Yüksek kalsiyum ve magnezyum konsantrasyonları, Pseudomonas aeruginosa suşlarına karşı aminoglikozidler, polimiksin B ve tetrasiklinlerin yanlış direncine neden olur.

-Düşük kalsiyum ve magnezyum konsantrasyonları, Pseudomonas aeruginosa suşlarına karşı aminoglikozidler, polimiksin B ve tetrasiklinlerin yanlış duyarlılıklarına neden olur.

-Çinko varlığı karbapenem disklerin (imipenem, meropenem ve ertapenem) sonuçlarını etkiler.

-Ortamın 3 mm'nin altındaki kalınlığı yanlış duyarlılık sonuçları verirken, 5'in üzerindeki kalınlık yanlış direnç üretecektir.

- Antibiyogramdaki disklerin mobilizasyonu, antibiyotiklerin hemen boşalması nedeniyle deforme olmuş haleler verecektir.

- Çok zayıf inokülümler sonuçları etkiler, çünkü agarda tek tip veya birleşik bir büyüme olmayacaktır, halelerin normalden daha büyük verebilmesine ek olarak inhibisyon halelerini ölçmek için gerekli bir durumdur.

-Aşırı yüklenmiş aşı, normalden daha küçük haleler verebilir.

-Diskler arasındaki mesafeye saygı duyulmaması, bir halenin diğeriyle örtüşmesine neden olur ve doğru okunamazlar.

CO ile -Incubate ₂ artar tetrasiklin ve metisiline disklerin haleler boyutu.

-35 ° C'nin altındaki sıcaklıklarda inkübe edin, daha büyük haleler oluşturur.

-Kan ilavesi sülfa halenin boyutunu azaltır.

sınırlama

Antibiyogramda gösterilen bir antibiyotiğin bir mikroorganizmaya (in vitro) karşı duyarlılığı, in vivo çalışacağının garantisi değildir.

QA

Besiyerinin yeterli miktarda timin içerip içermediğini bilmek için, bir Enterococcus faecalis ATCC 29212 suşu ekilmeli ve trimetoprim sülfametoksazole (SXT) duyarlılığı test edilmelidir, tatmin edici olması için 20 mm'ye eşit veya> 20 mm bir halo vermelidir.

Referanslar

1. "Müller-Hinton agar." Vikipedi, bedava ansiklopedi. 16 Kasım 2018, 12:23 UTC. 27 Ocak 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Mikrobiyolojik Tanı. 12 ed. Editoryal Panamericana SA Arjantin.
3. Cona E. Agar difüzyon testi ile iyi bir duyarlılık çalışması için koşullar. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratuvarı. % 5 koyun kanı içeren Müeller Hinton agar. 2009. Şu adresten ulaşılabilir: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II Agar Laboratuvarı. 2017. Şu adresten ulaşılabilir: .bd.com
6. Britannia Laboratuvarları. Müeller Hinton agar. 2015. britanialab.com'da bulunabilir
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiyolojik Tanı. 5. baskı. Editoryal Panamericana SA Arjantin.
8. Martínez-Rojas D. AmpC tipi betalaktamazlar: Fenotipik saptama için genellikler ve yöntemler. Rev. Soc Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Şu adresten ulaşılabilir: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N.Pseudomonas aeruginosa'nın klinik izolatlarında metalobetalaktamazların fenotipik tespiti. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Şu adresten ulaşılabilir: scielo.org.