FOSFAT TAMPONU (PBS): MANTIK, HAZIRLIK VE KULLANIMLAR - BIYOLOJI - 2025

Fosfat tamponu, fosfat tamponlu salin veya BPS , fonksiyonu olan izotonik bir tampon, bir için doğal biyolojik ortamda (fizyolojik) yakın bir şekilde pH ve ozmotik basınç sağlar. PBS kısaltması, fosfat tamponlu salin anlamına gelir.

PH ve ozmolarite, belirli laboratuvar protokollerinde kontrol edilmesi gereken çok önemli iki husustur. PH söz konusu olduğunda, özellikle biyokimyasal reaksiyonlarda kontrol edilmesi önemlidir, çünkü bunlar değişebilir veya reaktanların uygun olmayan bir pH'ta olması durumunda gerçekleştirilmeyebilir.

PBS fosfat tamponlu salin iki farklı pH'ta. Kaynak: Pixinio.com

Bu arada, ozmolaritenin kontrolü, özellikle canlı hücrelerle çalışırken önemlidir, çünkü hücrelerin plazma zarları, içinde bulundukları çözünen maddelerin konsantrasyonuna göre reaksiyona girer.

Hücreler hipertonik bir ortama aktarılırsa, su gradyanı daha yüksek konsantrasyonda çözünen maddelerin olduğu tarafa taşınacağından dehidre olurlar. Öte yandan, hücreler hipotonik bir ortama yerleştirilirse, hücreler parçalanana kadar sıvıyı emer.

Bu nedenle PBS tamponu, hücrelerin in vitro bakımını gerektiren laboratuvar protokolleri için kullanılır, bu şekilde hücreler zarar görmez.

PBS, sodyum klorür, sodyum fosfat, potasyum klorür ve potasyum fosfat gibi tuzların bir kombinasyonundan oluşur. PBS'nin bileşimi protokole bağlı olarak değişebilir.

temel

Temel olarak fosfat tamponlu salinin işlevi, vücudun içinde bulunana benzer bir elektrolit konsantrasyonu ile birlikte sabit bir fizyolojik pH'ı korumaktır.

Bu ortamda, fizyolojik koşullar mümkün olduğu kadar simüle edildiği için hücreler stabil kalabilir.

Gerekirse orijinal PBS formülasyonuna başka bileşikler de eklenebilir, örneğin tampona EDTA'nın eklenmesi çapraz uyumsuzluk testinde kırmızı kan hücrelerinin yıkanması için yararlıdır.

EDTA, serumda bulunan tamamlayıcı C1 fraksiyonunun parçalanmasını ve kırmızı kan hücrelerine parçalanmasını önler, yani yanlış uyumsuzluk sonuçlarını önler. Ayrıca EDTA, hücrelerin ayrılmasına yardımcı olur.

Hazırlık

PBS fosfat tamponlu salinin hazırlanması için tartılması gereken tuzların miktarı hazırlanması gereken miktara bağlı olacaktır:

-Fosfat tamponlu salin stok solüsyonu (10X PBS)

Bir litre çözelti için:

Tartmak:

80.6 g NaCl,

2,2 g KCl,

11.5 Na g ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Hazırlık tekniği

Ağır tuzları bir beher içerisine koyun, yeterli miktarda su (% 80) ekleyin ve tuzlar çözülene kadar manyetik çubukla karıştırma plakasında karıştırın.

Manyetik çubuklu bir karıştırma plakası kullanılarak PBS'nin hazırlanması. Kaynak: Kullanıcı: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Çözünmemiş parçacıkları çıkarmak için filtre edin. 0,45 µm gözenekli filtreler kullanın. Otoklavlayın ve kapaklı cam kavanozlarda laminer akış davlumbazında aseptik olarak dağıtın.

10X solüsyonu (konsantre) pH'ı ayarlamaz. 1X PBS tampon konsantrasyonuna (1:10 seyreltme) seyreltildikten sonra ayarlama yapılır.

-Tampon fosfat salin (1X PBS)

1X PBS, her bir tuzun karşılık gelen miktarları tartılarak doğrudan hazırlanabilir veya stok çözeltisinin (1:10) steril damıtılmış su ile seyreltilmesiyle hazırlanabilir.

- Doğrudan bir litre 1X PBS fosfat tamponlu salin hazırlamak için, tartın:

8.06 g NaCl,

0.22 g KCl,

1.15 Na g ₂ HPO ₄ ,

0.20 g KH ₂ HPO ₄

Hazırlık tekniği

Konsantre solüsyonda açıklandığı gibi devam edin. Daha sonra pH ayarlanmalıdır. Bunu yapmak için pH'ı ölçün ve sonuca bağlı olarak pH'ı 7.4 olana kadar gerektiği gibi düşürmek veya yükseltmek için asit (HCl) veya baz (NaOH) kullanın.

Çözeltinin pH değeri bir pH metre kullanılarak izlenirken asit veya baz damla damla eklenir. Filtreleyin, otoklavlayın ve gerektiği gibi konik tüplere veya kavanozlara aseptik olarak dağıtın.

-10X stok çözümünden 1X PBS hazırlamak için:

1:10 seyreltme yapın. Örneğin, 1 litre 1X PBS hazırlamak için, 100 ml stok çözeltisi ölçün ve 700 ml steril damıtılmış su ekleyin. PH'ı ayarlayın ve su miktarını 1000 ml'ye kadar doldurun.

Hazırlanan PBS tamponu renksiz ve berraktır.

Günlük PBS, oda sıcaklığında ve geri kalanı buzdolabında saklanabilir.

PH ayarlaması için çözümler

HCl

100 ml 1 molar HCL (hidroklorik asit) için.

91 mL distile su ölçün ve 250 mL'lik bir behere koyun.

8.62 mL konsantre HCl ölçün ve yavaşça su içeren behere ekleyin (asla tersini yapmayın). Güçlü asitlerle (oldukça aşındırıcı madde) çalışırken uygun biyogüvenlik önlemlerini alın.

Tercihen cam içinde manyetik çubuk bulunan bir karıştırma plakası kullanarak 5 dakika karıştırın. 100 ml'lik bir şişeye aktarın ve distile H ₂ O ile 100 ml'ye tamamlayın .

NaOH

100 ml NaOH (sodyum hidroksit) için 10 molar.

40 mL distile su ölçün ve 250 mL'lik bir behere koyun. 40 g NaOH ölçün ve suya ekleyin. Cam içinde manyetik çubuk bulunan bir karıştırma plakası kullanarak karıştırın.

100 ml'lik balon jojeye aktarılır ve damıtılmış su ile işarete kadar tamamlanır. Biyogüvenlik yönetmeliklerine uyun, çünkü bu reaksiyon ekzotermiktir (ısı şeklinde enerji açığa çıkarır).

Başka miktarlarda fosfat salin solüsyonu hazırlamak istiyorsanız, aşağıdaki tabloya başvurabilirsiniz:

Kaynak: «Viral ve İnsan Genomik Laboratuvarı, UASLP Tıp Fakültesi»

Uygulamalar

Öncelikle hücre biyolojisi, immünoloji, immünohistokimya, bakteriyoloji, viroloji ve araştırma laboratuvarlarında kullanılır.

Santrifüj (kırmızı kan hücreleri), hücre tek tabakalı yıkamalar, spektroskopik elipsometri tekniklerinde, bakteriyel biyofilmlerin miktar tayininde, virüsler için hücre kültürlerinin bakımında, indirekt immünofloresan tekniğinde yıkama solüsyonu olarak hücre yıkaması için idealdir. ve monoklonal antikorların karakterizasyonu için tekniklerde.

Aynı zamanda hücre sayımı için seyreltici olarak, hücresel enzimlerin (tripsin) hazırlanmasında, biyomolekül desikasyon yöntemi için seyreltici olarak ve diğer reaktifleri hazırlamak için hücreleri veya dokuları taşımak için kullanılır.

Öte yandan Martin ve arkadaşları 2006 yılında PBS'nin adli tıp laboratuvarlarında özellikle vajinal smearlardan spermin geri kazanılmasında veya vajinal hücrelerin penis yaymalarından geri kazanılmasında yararlı olduğunu gösterdi. Bu şekilde cinsel bir ilişki olup olmadığı tespit edilebilir.

Sınırlamalar

-Bazı PBS tamponları koruyucu olarak sodyum azid adı verilen bir madde içerir. Bu bileşik, kurşun veya bakır ile temas ederse patlayıcı maddeler oluşturabilir. Bu nedenle, bu reaktifi kanalizasyona atarken özel dikkat gösterilmelidir. Bu şekilde atılırsa, maksimum seyreltilmesi için bol su ilave edilmelidir.

-Zinc fosfat tamponuna bazı tuzların çökelmesine neden olduğundan çinko eklenmemelidir.

-Wangen ve ark. 2018 yılında PBS kullanımının, materyalde büyük bir azalma ile birçok hücrenin parçalanması nedeniyle kaybolması nedeniyle periferik kandan ekstrakte edilen birincil akut miyeloid lösemi (AML) hücrelerini yıkamak için uygun olmadığını belirledi. protein.

Bu nedenle, sıvı nitrojende depolandıktan sonra birincil AML hücrelerinin PBS ile yıkanmaması gerektiğini belirlediler.

Referanslar

1. Coll J. (1993). Virolojide teşhis teknikleri. Ed Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Hücre kültürü. Ortam Değişimi. Seville Üniversitesi Normal ve Patolojik Sitoloji ve Histoloji Bölümü. Personal.us.es adresinde mevcuttur
3. Fosfat Tamponlu Salin (PBS) Hazırlanması. (2008). Standart Operasyon Prosedürleri (SOP'ler) İnsan ve Viral Genomik Laboratuvarı UASLP Tıp Fakültesi. Mevcut: genomica.uaslp.mx
4. "Fosfat Tamponlu Salin." Vikipedi, bedava ansiklopedi. 3 Nisan 2019, 19:36 UTC. 13 Nisan 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Moleküler biyofizikte konular. Kullanılabilir: users.df.uba.ar
6. Rediar. Manuel. PBS + EDTA. Felsan.com.ar adresinde mevcuttur
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Swablardan hücrelerin ve spermlerin geri kazanılması için fosfat tamponlu salin kullanımı. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. Mevcut: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, ve diğerleri. Koruma Yöntemi ve Fosfat Tamponlu Salin Yıkama Akut Miyeloid Lösemi Proteomunu Etkiler. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Mevcut: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Histokimyanın teorik ve pratik temelleri. Üstün Bilimsel Araştırma Konseyi. Madrid. Books.google.co.ve adresinde mevcuttur