DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOLE): ÖZELLIKLER, MANTIK, KULLANIM - KIMYA - 2025

DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindol) floresan özelliği tarafından bir boya olarak hizmet eder , bir işaretleyici, yaygın olarak floresans mikroskobu tekniğinde kullanılan veya diğerleri arasında, akış sitometrisi. Yaydığı floresan parlak mavidir, uyarımı 455-461 nm (UV ışığı) arasında gerçekleşir.

DAPI boyası, ölü hücrelerin hücre zarından büyük kolaylıkla geçebilir. Aynı zamanda canlı hücrelerin çekirdeklerini de boyayabilir, ancak bu durumda bunun konsantrasyonu daha yüksek olmalıdır.

Floresan boya DAPI'nin kimyasal yapısı. Kaynak: Resim: Dosya: DAPI.svg, bu dosyanın vektör sürümüdür. Daha aşağı olmadığında bu raster görüntünün yerine kullanılmalıdır / Richard Wheeler (Zephyris) Düzenlenmiş görüntü

Boya, adenin ve timine azotlu bazlara büyük bir istekle bağlanarak, özel bir afiniteye sahip olduğu hücresel DNA'ya erişebilir. Bu nedenle bazı moleküler biyoloji tekniklerinde çok faydalıdır.

Bu bileşik, indol boyalar grubuna aittir ve özellikle agaroz jellerde, etidyum bromür ve propidyum iyodürden daha fazla DNA duyarlılığına sahip olduğu gösterilmiştir.

Bu floresan boyanın kullanımı, aşağıdakiler için yararlı olduğu için çok geniştir: apoptotik süreçlerde (hücre ölümü) DNA'daki değişiklikleri incelemek ve dolayısıyla bu süreçte hücreleri saptamak; DNA ayak izi fotoğrafı için (DNA fotoğraf baskısı); bakteriyel kontaminasyonu incelemek; veya nükleer segmentasyonu görselleştirmek için.

Ayrıca kromozomal bantların çalışmasında, Mycoplasmas sp DNA'nın saptanmasında, DNA-protein etkileşiminde, immünofloresans ile hücrelerin boyanmasında ve sayılmasında ve hatta olgun polen tanelerinin renklendirilmesinde kullanılmıştır.

karakteristikleri

DAPI, kimyasal adının (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) kısaltmasıdır. Moleküler formülü, C ₁₆ H ₁₅ N _5. Bu 350.3 bir molekül ağırlığına sahiptir. UV ışık aralığının yakınında (345 ila 358 nm) DAPI-DNA kompleksinin maksimum uyarımı meydana gelirken, maksimum floresans emisyonu 455-461 nm arasında gerçekleşir.

Bu boya sarı bir toz olarak nitelendirilir, ancak bu floroforla işaretlenen yapılar parlak mavi bir ışık yayar.

Suda çözünebilen bir bileşiktir, ancak çözünmesini hızlandırmak için bir miktar ısı uygulanabilir. PBS ile seyreltilebilir ancak doğrudan içinde çözülemez.

Boya hazırlandıktan sonra karanlıkta yani ışıktan korunarak 2 ila 8 ° C (buzdolabı) arasında saklanmalıdır. Bu koşullar altında, boya 3 hafta veya aydan fazla stabildir.

Işıktan korunur ancak oda sıcaklığında bırakılırsa stabilitesi 2 veya 3 haftaya düşer, ancak doğrudan ışığa maruz kalırsa bozulma çok hızlıdır. Çok daha uzun süre saklamak isterseniz, -20 ° C'de soğutulabilir ve bölücüler halinde dağıtılabilir.

temel

Bu boyama, akış sitometrisi, floresan mikroskobu ve metafaz kromozomlarının veya fazlar arası çekirdeklerin boyanması gibi ana moleküler biyoloji tekniklerinde nükleer bir karşı boyama oluşturmaya dayanır.

Bu teknik, boyanın minör oluktaki genetik materyalde (DNA) bulunan azotlu bazlar (adenin ve timin) için sahip olduğu büyük afiniteye dayanmaktadır. Sitoplazmik seviyedeyken çok az arka plan bırakır.

Floresan boya, DNA'nın adenin ve timin bölgelerine bağlandığında, floresan önemli ölçüde artar (20 kat daha fazla). Yaydığı renk parlak mavidir. Özellikle, GC (guanin-sitozin) baz çiftlerine bağlanırken floresan emisyonu yoktur.

Aynı zamanda RNA için bir afinitesine sahip olmasına rağmen, bunun bir soruna neden olmadığını not etmek önemlidir, çünkü bu molekülden en yüksek enerji emisyonu, 460'da bunu yapan DNA'nın aksine, başka bir dalga boyunda (500 nm) meydana gelir. mil. Ayrıca, RNA'ya bağlandığında floresandaki artış sadece% 20'dir.

DAPI, ölü (sabitlenmiş) hücreleri canlı hücrelerden daha fazla boyamak için kullanılır, çünkü ikincisini boyamak için çok daha yüksek bir boya konsantrasyonu gereklidir, bunun nedeni, hücre zarının canlı olduğunda DAPI'ye çok daha az geçirgen olmasıdır.

DAPI boyası, çok renkli bir deneyim için kırmızı ve yeşil floroforlarla kombinasyon halinde kullanılabilir.

kullanım

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) mükemmel bir florofordur ve bu nedenle çeşitli tekniklerde ve çeşitli amaçlarla yaygın olarak kullanılmaktadır. Aşağıda DAPI'nin ana tekniklerde kullanımı açıklanmaktadır.

Akış sitometrisi

Araştırmacılar Gohde, Schumann ve Zante, 1978'de akış sitometrisi tekniğinde DAPI'yi bir florofor olarak kullanan ve öneren ilk kişilerdi ve DNA'ya karşı yüksek duyarlılığı ve floresan emisyonundaki yüksek yoğunluğu nedeniyle büyük başarı elde ettiler.

DAPI'nin bu teknikte kullanılması, hücre döngüsünün çalışılmasına, hücrelerin ölçülmesine ve canlı ve ölü hücrelerin boyanmasına izin verir.

Etidyum bromür, Hoechst oksit, akridin turuncusu ve propidyum iyodür gibi başka renklendiriciler olmasına rağmen, DAPI, daha önce belirtilenlerden daha fazla fotostabil olduğu için en yaygın kullanılanlardan biridir.

Bu teknik için hücrelerin sabitlenmesi gerekir, bunun için mutlak etanol veya% 4 paraformaldehit kullanılabilir. Numune santrifüjlenir ve süpernatan atılır, ardından hücreler 15 dakika 5 ml PBS tamponu eklenerek hidratlanır.

Zaman geçerken, DAPI boyasını 3 µM konsantrasyonda bir boyama tamponu (BioLegend'den FOXP3) ile hazırlayın.

Örneği santrifüjleyin, süpernatantı atın ve ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1 ml DAPI solüsyonu ile örtün.

Numuneyi uygun lazerle akış sitometresine alın.

Akış Mikroflorometrisi

DAPI'nin kullanıldığı başka bir teknik, akış mikro-florometrisinde, mitramisin adı verilen başka bir florofor ile birlikte kullanılır. Her ikisi de kloroplast DNA'sını ayrı ayrı ölçmek için kullanışlıdır, ancak DAPI, T4 bakteriyofaj partiküllerini ölçmek için en uygunudur.

melezleme

Bu teknik temelde DAPI olabilen bir floresan boya ile etiketlenmiş DNA problarını kullanır.

Numune, çift sarmallı DNA'yı denatüre etmek ve onu iki tek sarmallı sarmala dönüştürmek için ısıl işlem gerektirir. Daha sonra ilgili diziye sahip DAPI etiketli denatüre bir DNA probu ile hibridize edilir.

Daha sonra melezlenmemiş olanı ortadan kaldırmak için yıkanır, DNA'yı görselleştirmek için bir kontrast kullanılır. Floresans mikroskobu, hibritlenmiş probun gözlemlenmesine izin verir.

Bu tekniğin amacı, kromozomal DNA'daki spesifik dizileri tespit etmek, belirli hastalıkların teşhisini yapabilmek.

Bu sito-moleküler teknikler, karyotip çalışmalarında ayrıntıların belirlenmesinde çok yardımcı olmuştur. Örneğin, heterokromatik bölgeler veya DAPI bantları olarak adlandırılan adenozin ve timinin baz çifti bakımından zengin bölgelerini gösterdi.

Bu teknik, bitkilerde ve hayvanlarda kromozom ve kromatinin incelenmesi ve ayrıca insanlarda doğum öncesi ve hematolojik patolojilerin teşhisinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bu teknikte önerilen DAPI konsantrasyonu 15 dakikalık bir süre için 150 ng / ml'dir.

Montajı yapılan slaytlar 2-8 ° C'de ışıktan korunarak saklanmalıdır.

İmmünofloresan boyama

Hücreler% 4 paraformaldehit ile sabitlenir. Diğer boyalar kullanılacaksa, DAPI sonunda karşıt boya olarak bırakılır ve hücreler 15 dakika PBS solüsyonu ile kapatılır. Zaman geçerken, nihai konsantrasyon 300 µM olacak şekilde PBS ile seyrelterek DAPI çözeltisini hazırlayın.

Daha sonra fazla PBS çıkarılır ve 5 dakika boyunca DAPI ile kapatılır. Birkaç kez yıkar. Slayt, uygun filtre altında bir floresan mikroskobu altında görüntülenir.

Güvenlik sayfası

Mutajenik özelliklere sahip bir bileşik olduğu için bu bileşik dikkatli kullanılmalıdır. Aktif karbon, bu bileşiği atılacak sulu çözeltilerden çıkarmak için kullanılır.

Bu reaktifle kazaları önlemek için eldiven, önlük ve güvenlik gözlükleri kullanılmalıdır. Deri veya mukoza ile temas oluşursa, bölge yeterince su ile yıkanmalıdır.

Bu reaktifi asla ağızla pipetlememelisiniz, pipet kullanmayınız.

Reaktifi mikrobiyal ajanlarla kontamine etmeyin çünkü bu hatalı sonuçlara yol açar.

Lekenin kalitesini önemli ölçüde azaltacağından DAPI boyasını önerilenden daha fazla seyreltmeyin.

Reaktifi doğrudan ışığa maruz bırakmayın veya bu floresansı azalttığı için sıcak tutmayın.

Referanslar

1. Brammer S, Toniazzo C ve Poersch L. Corantes genellikle bitki sitogenetiğinde yer alır. Arq Inst. Biol.2015, 82. Şuradan alınabilir: scielo.
2. Impath Laboratuvarları. DAPI. Menarinidiagnostics.com/ adresinde mevcuttur
3. Cytocell Laboratuvarları. 2019. DAPI kullanım talimatları. cytocell.com'da mevcuttur
4. Elosegi A, Sabater S. Nehir ekolojisinde kavram ve teknikler. (2009). Editoryal Rubes, İspanya. Books.google.co.ve/ adresinde mevcuttur
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Kardiyak dokudaki miyosit sayısını tahmin etmek için modifiye bir disektör yönteminde floresans kullanımı. Arch Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Kullanılabilir: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Meksika'daki papayada (Carica papaya) fitoplazmaların varlığı. Chapingo Dergisi. Bahçe Bitkileri serisi, 2011; 17 (1), 47-50. Şu adresten ulaşılabilir: scielo.org.