İMMÜNOFLORESAN: MANTIK, PROTOKOL VE UYGULAMALAR - BIYOLOJI - 2025

İmmünofloresan kovalent bir katı destek üzerine sabit hücre örneklerinde spesifik hedeflerini tanımlamak için flüoresan moleküllerine bağlanmış antikorlar kullanılarak imüno-boyama güçlü bir tekniktir.

Bu teknik, immünolojik özgüllük ile mikroskobik gözlemi içerir ve çok az miktarda antijen sunabilen canlı veya ölü hücreleri gözlemlemeyi mümkün kılar. Hem araştırma alanında hem de çeşitli patolojilerin klinik teşhisinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Kardiyomiyosit hücrelerinde aktin filamanlarının immüno-etiketlenmesi (Kaynak: Ps1415, Wikimedia Commons aracılığıyla)

Esasen kalitatif (bazı kantitatif varyantlarla) olan bu teknik, spesifik olarak, bir antikora bağlı floresan bir molekül olan ve belirli bir dalga boyunda uyarılabilen bir floroforun ürün sinyali ile bir numunenin görselleştirilmesiyle ilgilidir. .

Hücresel bağlamda, proteinlerin varlığını / yokluğunu ve hücre altı konumunu incelemek çok faydalıdır. Teknik başlangıçta klinik ortamda influenza gibi virüslerin teşhisi için ve ardından diğer birçok bulaşıcı hastalık için kullanıldı.

Oldukça hassas bir tekniktir ve uygun mikroskopi ekipmanı ile çok iyi çözünürlüğe sahip olabilir. Gözlemlenmesi için konfokal veya epifloresan mikroskopların kullanılmasını gerektirir.

Bununla birlikte, çok popüler olmasına rağmen, genellikle sonuçların yeterli okunmasını sınırlayan bir miktar arka plan "gürültüsü" üreten spesifik olmayan floresan elde etme açısından bazı önemli sorunlar ortaya çıkarabilir.

temel

İmmünofloresan, bir antikor ile bir antijen arasındaki etkileşim reaksiyonunun biyolojik olgusundan yararlanılmasına dayanır. Floresan molekülleri belirli bir dalga boyunda uyararak bu reaksiyonun özellikle görselleştirilmesi veya saptanmasıyla ilgisi vardır.

Bir antikor, aktif B hücrelerinden salgılanan ve yüksek afinite ve özgüllükle bağlanabildiği bir antijene karşı spesifik olarak üretilen bir immünoglobulin proteinidir. İmmünofloresan, kan serumunda çözünür bulunan IgG immünoglobulinleri kullanır.

Antikorlar, iki kısa (hafif) ve iki uzun "Y" şekilli (ağır) peptit zincirinden oluşan 950 kDa'ya kadar moleküllerdir. Hem hafif hem de ağır zincirler iki alana bölünmüştür: bir değişken, antijeni tanıyabilir ve diğeri sabit veya korunmuş, her türün karakteristiğidir.

Antijenler, fonksiyonel olarak bir antikor tarafından tanınabilen ve çoğunlukla protein olan moleküller olarak tanımlanır. Bir hayvan bir antijene maruz kaldığında, bağışıklık sisteminin lenfositleri aktive olur, ona karşı spesifik antikorlar üretir ve bu bir savunma sistemi işlevi görür.

Örneğin bir protein gibi bir antijen, birden fazla epitopa veya bir antikor tarafından tanınma alanına sahip olabilir, dolayısıyla bir antijene maruz kalan hayvanın serumu, aynı proteinin farklı bölgelerine karşı poliklonal antikorlara sahip olabilir.

İmmünofloresans, daha sonra, bir hayvanın, onu saflaştırmak ve daha sonra aynı antijeni başka bağlamlarda saptamak için kullanmak üzere belirli bir antijene karşı poliklonal antikorlar üretme yeteneğinden yararlanır.

Bazı immünofloresan teknikler için en çok kullanılan floresan boyalar veya moleküller arasında floresein izotiyosiyanat (FITC), tetrametilrhodamin izotiyosiyanat-5 ve 6 (TRITC), Cy2, Cy3, Cy5 ve Cy7 gibi birçok siyanin ve Alexa Fluor® adı verilen boyalar bulunur. Alexa Fluor®448 gibi.

Protokol

İmmünofloresan protokolü birçok faktöre bağlı olarak değişir, ancak genel anlamda aşağıdakilerden oluşan doğrusal bir adım dizisini kapsar:

• Plakaların ve hücrelerin hazırlanması
• Numunelerin sabitlenmesi
• permeabilization
• bloke etme
• İmmün boyama veya immün boyama
• Montaj ve gözlem

-Hazırlık

Örneklerden

Numunelerin hazırlanması, doğalarına ve gerçekleştirilecek deneyim türüne bağlı olacaktır. Hücrelerin süspansiyon halinde kullanılmasını içeren en basit durum aşağıda açıklanacaktır.

Süspansiyondaki, yani sıvı bir kültür ortamındaki hücreler, önce santrifüjleme yoluyla ondan ayrılmalı ve daha sonra bütünlüklerini koruyan bir tampon solüsyonu veya izosmotik "tampon" ile yıkanmalıdır.

Normalde PBS olarak bilinen bir fosfat-salin tamponu kullanılır, burada hücreler yeniden süspanse edilir ve bu karışım, müdahale edici maddeler içerebilen kültür ortamından arınmış hücreleri elde etmek için tekrar santrifüjlenir.

Bıçakların

Mikroskobik gözlem için kullanılan, hücrelerin daha sonra karşılık gelen aşağı akış işlemleri için sabitleneceği slaytlar da dikkatlice hazırlanmalıdır.

Bunlar, amino gruplarının pozitif yükleri arasındaki elektrostatik etkileşim sayesinde hücreler ve katı destek arasında bir "moleküler yapıştırıcı" görevi görecek sentetik bir polimer olan poli-lizin çözeltisiyle kaplanır veya "hassaslaştırılır". hücreleri kaplayan proteinler üzerindeki negatif yükler.

Numunelerin sabitlenmesi

Bu işlem, uzaysal konumlarını sağlam tutmak için hücre içinde bulunan proteinlerin hareketsizleştirilmesinden oluşur. Kullanılan moleküller, her tür hücre zarını geçebilmeli ve kovalent proteinlerle kafes oluşturabilmelidir.

Formaldehit ve paraformaldehit, glutaraldehit ve hatta metanol, hücre örneklerinin belirli bir süre inkübe edildiği ve ardından izosmotik bir tampon solüsyonu ile yıkandığı yaygın olarak kullanılmaktadır.

Hücreler sabitlendikten sonra, önceden poli-lizin ile duyarlılaştırılmış tabakalara bağlanmaya devam ederler.

permeabilization

Yapılan testin türüne bağlı olarak, incelenen hücrelerin geçirgen hale getirilip getirilmemesi gerekli olacaktır. Aranan şey, hücre yüzeyinde belirli bir proteinin yerini, varlığını veya yokluğunu bilmekse, geçirgenleştirme gerekli olmayacaktır.

Öte yandan, bir proteinin hücre içindeki yerini bilmek istiyorsanız, geçirgenlik gereklidir ve numunelerin hücre zarlarını geçirgen hale getirebilen bir deterjan olan Triton X-100 ile inkübe edilmesinden ibarettir.

bloke etme

Tüm immünolojik tekniklerde temel bir adım bloke etmektir. Prosedürün bu aşamasında, bloke etme, duyarlı hale getirilmiş tabakalar üzerinde hücrelerin yapışmadığı poli-lizin molekülleri ile tüm bölgelerin örtülmesinden oluşur. Yani herhangi bir spesifik olmayan birleşmeyi engeller.

Normalde PBS tamponunda sığır serum albümini (BSA) içeren solüsyonları bloke etmek için kullanılır ve en iyi sonuçlar bu solüsyonla inkübasyon süresi uzadıkça elde edilir. Engelleme dahil her adımdan sonra, kalan çözeltinin yıkanması gerekir.

İmmün boyama veya immün boyama

İmmün boyama veya immün boyama prosedürü esas olarak bunun doğrudan veya dolaylı bir immünofloresan olup olmadığına bağlı olacaktır (aşağıya bakınız).

Birincil veya doğrudan bir immünofloresan ise, numuneler, floresan boyalara bağlanması gereken istenen antikorlarla inkübe edilecektir. İnkübasyon prosedürü, aynı zamanda BSA da içerecek, ancak daha düşük bir oranda antikorun bir çözelti içinde seyreltilmesinden oluşur.

İkincil veya dolaylı bir immünofloresan söz konusu olduğunda, iki ardışık inkübasyon gerçekleştirilmelidir. Önce istenen antikorlarla ve ardından birincil immünoglobulinlerin sabit bölgelerini tespit edebilen antikorlarla. Floroforlara kovalent olarak bağlanan bu ikincil antikorlardır.

Bu teknik çok yönlüdür ve doğrudan immünofloresans durumunda farklı floroforlara bağlı birincil antikorlar olduğu sürece, numune başına birden fazla antijenin aynı anda etiketlenmesine izin verir.

Dolaylı immünofloresansta eşzamanlı etiketleme için, her birincil antikorun farklı bir hayvanda üretilmesinin yanı sıra her bir ikincil antikorun farklı bir florofora bağlanmasını sağlamak gerekir.

Bloklama gibi, antikorlarla inkübasyon, bunun süresi ne kadar uzun olursa, daha iyi sonuçlar verir. Her adımdan sonra, örneklere bağlanmayan fazla antikorları yıkamak gerekir ve ikincil immünofloresansta ikincil antikoru eklemeden önce bloke etmek gerekir.

Nükleer DNA'nın DAPI florofor ile boyanması gibi bazı teknikler immün boyama ile ilgili olmayan diğer boyaları kullanır.

Montaj ve gözlem

Floroforlarla son inkübasyon süresi boyunca, örneklerin karanlıkta kalması gerekir. Mikroskop altında gözlem için, antikorlara bağlı floroforların floresansını korumak için bazı maddelerin kullanılması yaygındır.

Türleri

Doğrudan ve dolaylı immünofloresanın grafik özeti (Kaynak: Westhayl618, Wikimedia Commons aracılığıyla)

Doğrudan veya birincil immünofloresan

Floresan antikorlar kullanılarak antijenlerin tespiti ile ilgilidir. Bu tekniği kullanmanın ana avantajı hızıdır, bununla birlikte, özellikle insan serumu incelendiğinde, oldukça heterojen antikorlar açısından zengin olduklarından, süreçte birçok spesifik olmayan bağlanma vakası meydana gelebilir.

Dolaylı veya ikincil immünofloresan

"Sandviç" tekniği olarak da bilinir ve bu, tekniğin iki aşamada geliştirilmesini içerir. Birincisi, floresan olmayan bir antikorun kullanılması ve bunun ilgili antijene bağlanması ile ilgilidir.

Bu birinci antikorun (şimdi antijen olarak hizmet edecek) sabit bölgesine karşı, onu tanıyabilen, bir flüoresan molekül ile ilişkili ikinci bir antikor kullanılır.

Bir flüoresan sinyalin ortaya çıkması, birinci flüoresan olmayan antikor ile ilgili antijen arasındaki spesifik tanımanın sonucu olacaktır; bu birinci antikorun varlığı, etiketlenen ve bu sayede antijenin varlığı veya yokluğunun belirlenebildiği ikincininkini koşullandırır.

Direkt immünofloresanstan çok daha fazla zaman alan bir teknik olmasına rağmen (bir daha inkübasyon adımı içerdiği için), bu teknik, çalışılan her antijen için bir floresan antikorun tasarımını içermez, bu da ekonomik açıdan sonuçlanır, daha uygun.

Ayrıca, birden fazla ikincil antikor birincil antikorun sabit bölgesine bağlanabildiği ve böylece flüoresan sinyalin yoğunluğunu artırabildiği için sinyal amplifikasyonu açısından daha hassas bir tekniktir.

Uygulamalar

Daha önce de belirtildiği gibi, immünofloresans, bilimsel ve klinik alanlarda birçok şekilde kullanılan son derece çok yönlü bir tekniktir. Birçok organizma ile ilgili ekolojik, genetik ve fizyolojik soruları cevaplamak için kullanılabilir.

Klinik uygulamalar arasında, incelenen hastaların epitel dokusunda doğrudan veya indirekt immünofloresans kullanılarak bazı dermatolojik hastalıkların doğrudan teşhisi için kullanılmaktadır.

İmmünofloresan teknikleri, maya gibi tek hücreli organizmalarda, intranükleer ve sitoplazmik mikrotübülleri, aktin ve ilgili proteinleri, 10 nm filamentleri ve sitoplazma, membran ve hücre duvarlarının diğer bileşenlerini görselleştirmek için mevcuttur.

Referanslar

1. Abcam, İmmünositokimya ve immünofloresan protokolü. Abcam.com'dan alındı
2. Greph, C. (2012). Floresan Boyalar. Leica-microsystems.com adresinden kurtarıldı
3. Miller, DM ve Shakest, DC (1995). İmmünofloresan Mikroskopisi. Methods in Cell Biology (Cilt 48, s. 365-394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID ve Cook, D. (2013). İmmünofloresan Teknikleri. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG ve Brian, K. (1991). Maya için immünofloresan yöntemler. Enzimoloji Yöntemlerinde (Cilt 194, sayfa 565-602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V ve Widelock, D. (1964). Halk Sağlığı Virolojisinde İmmünofloresans Uygulamaları. Bakteriyolojik İncelemeler, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG ve Anderson, DM (1996). Fitoplankton araştırmalarında immünofloresan: uygulamalar ve potansiyel. J: Phycol. , 32, 1–16.