OKSIDAZ TESTI: MANTIK, PROSEDÜR VE KULLANIMLAR - BIYOLOJI - 2025

Oksidaz testi bir teşhis metodu olduğu Şekil enzim kompleksi olarak adlandırılan sitokrom oksidaz c varlığı. Bu sistem, oksijeni yakaladığı ve bu da solunum zincirindeki son elektron alıcısı (H ⁺ ) olarak görev yaptığı için indirgenmiş sitokromun dönüşümünü indükler .

Oksidaz terimi, indofenol oksidaz olarak da bilinen sitokrom oksidaz enzimine atıfta bulunmanın kısa bir yoludur. Antik çağlarda sitokrom oksidaz ve indofenol oksidaz enzimlerinin iki farklı enzim olduğuna inanılıyordu, ancak bugün aynı oldukları biliniyor.

Pozitif ve Negatif oksidaz testi. Kaynak: Makine tarafından okunabilen yazar sağlanmadı. Alpha.prim ~ commonswiki varsayıldı (telif hakkı taleplerine göre).

Sitokromlar, demir içeren ve sitokrom oksidaz sistemini tamamlayan hemoproteinlerdir. Sitokromlar türden türe değişebilir.

Farklı sitokrom çeşitleri vardır (sitokromlar a1, a2, a3 ve 0). Bazı bakteriler yalnızca bir tane üretirken, diğerleri bir seferde iki veya üçe kadar üretebilir. Bu anlamda, sitokrom a ve a3'ün varlığı sitokrom oksidaz c olarak bilinir. Bu, oksidaz testinin tespit ettiği sitokrom türüdür.

Neisseria ve Pseudomonas cinsi sitokrom oksidaz c içerir. Bu cinsler, sırasıyla Acinetobacter ve Stenotrophomonas cinslerinden ayırt edilmelerine yardımcı olarak pozitif oksidaz testi verir.

Oksidaz pozitif olan başka cinsler de vardır.

temel

Sitokrom oksidaz c sisteminin özellikleri

Sitokrom oksidaz c sistemi şu şekilde çalışır: oksidaz pozitif mikroorganizmalar, aerobik solunum yoluyla enerji üretmek için oksijeni kullanır. Bu sistem, elektronların NADH ⁺ gibi verici maddelerden reseptör maddelerine, bu durumda oksijene taşınması sayesinde çalışır .

Bu, mikroorganizmanın sahip olduğu sitokrom oksidaz sistemine bağlı olarak enerji (ATP) ve su veya hidrojen peroksit üretimiyle sonuçlanır.

Bu nedenle oksidaz pozitif bakterilerin çoğu aynı zamanda katalaz pozitiftir, bu da üretilen hidrojen peroksiti ortadan kaldırmak için gerekli bir koşuldur, çünkü bu madde bakteriler için toksiktir.

Sitokrom oksidaz c sistemi, bazı aerobik bakterilerde, bazı fakültatif anaeroblarda, birkaç mikroaerofilik olanlarda bulunur ve katı anaeroblar yoktur. İkincisi anlaşılabilir, çünkü katı anaeroblar oksijen varlığında yaşayamazlar, bu nedenle sitokrom oksidaz sisteminden yoksundurlar.

Test prensibi

Bu testte, yapay elektron alıcısı olarak hareket eden ve elektron taşıma zincirindeki doğal olanların yerini alan maddeler kullanır.

Esas olarak, reseptör substratları ve yapay elektron donörleri olarak işlev gören parafenilendiamin ve indofenol gibi boyalar kullanılır.

Parafenilendiamin, sitokrom oksidaz c sistemi tarafından oksitlenir. İndirgenmiş haldeki boya renksizdir, ancak oksitlenmiş haliyle renklidir.

Sitokrom oksidaz c sisteminin varlığı bu şekilde kanıtlanır; Pozitif bir reaksiyon, kullanılan reaktife bağlı olarak bir lavanta veya mavi-mor renk oluşturacağından.

Öte yandan solunum zincirindeki son elektron kabul eden madde oksijenden farklı ise oksidaz testi negatif olacaktır (renk üretimi yoktur); anaerobik mikroorganizmalar için durum budur.

Aynı şekilde mikroorganizmanın kullandığı sitokrom sitokrom oksidaz c'den farklı ise negatif testi de verecektir.

süreç

Oksidaz testi için hepsi aynı amaca yönelik çeşitli reaktifler ve protokoller vardır.

Reaktifler

Kovacs reaktifi, Gordon ve McLeod reaktifi, Nadi reaktifi, Carpenter, Suhrland ve Morrison reaktifi ve oksidaz disklerinin kullanımı.

-Kovacs oksidaz reaktifi

% 1 tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorürden oluşur.

Kovacs reaktifi, yukarıda belirtilen maddenin 1 g'ını 50 ml damıtılmış suda çözerek hazırlanır. Tamamen eriyene kadar hafifçe ısıtılır. Kehribar rengi bir şişeye aktarın ve hacmi distile su ile 100 ml'ye tamamlayın. Kullanmadan önce en az 15 dakika bekleyin. Işıktan korunan bir buzdolabında saklayın.

Indol testini ortaya çıkarmak için kullanılan Kovacs reaktifinden ayırt etmek için Kovacs oksidaz reaktifi olarak etiketlenmiştir. Bu reaktif en hassas, daha az toksik ancak diğer reaktiflerden daha pahalıdır.

Bu reaktifle, hızla mora neredeyse siyaha dönüşen lavantaya koloni rengi değişimi ile pozitif bir reaksiyon kanıtlanacaktır. Negatif bir reaksiyon belirgindir çünkü kolonide renk değişikliği yoktur veya hafif pembemsi bir renk alır. Ortam da kararabilir, ancak bu olumlu bir reaksiyon anlamına gelmez.

Bu reaktifle reaksiyon süresi çok önemlidir, 5 ila 15 saniye arasında meydana gelen renk değişikliği pozitif reaksiyon olarak kabul edilir.

-Gordon ve McLeod reaktifi

N-dimetil-p-fenilendiamin veya p-aminodimetilanilin monohidroklorür olarak da bilinen dimetil-p-fenilendiamin dihidroklorürden oluşur. İlgili madde yerine Kovacs oksidaz reaktifi için açıklandığı gibi hazırlanır.

Bu reaktif, Kovacs oksidaz reaktifinden biraz daha kararlıdır, ancak p-fenilendiamin içeren tüm reaktifler kararsızdır.

Bu reaksiyon daha sonra 10 ila 30 dakika içinde mavi-mor bir renk görünümüyle pozitif olarak yorumlanır.

-Nadi reaktifi

Etil alkol (% 95 etanol) içinde% 1 α-naftol ve% 1 aminodimetilanilinden oluşur. Karışım eşit parçalar halinde ve seyreltici olarak saf etil alkol kullanılarak 100 ml için yeterli bir miktar oluşturana kadar hazırlanır.

-Carpenter, Suhrland ve Morrison reaktifi

% 1 p-aminodimetilalanin oksalattan oluşur. İlgili madde için değiştirerek Kovacs oksidaz reaktifi için açıklananla aynı şekilde hazırlayın.

Solüsyon hazır olduğunda test şeritleri şu şekilde hazırlanır: 6-8 cm Whatman No. 1 filtre kağıdı şeritleri% 1 dimetil-p-fenilendiamin oksalat reaktifi ile emprenye edilir.

Metal ile temas etmeden kurumasına izin verilir, vidalı kapaklı kavanozlarda kurutucu ile saklanır ve buzdolabında saklanır. Bu şeritler 6 aya kadar stabildir.

Bahsedilenlerin en kararlı reaktifidir ve çözelti içinde 6 aya kadar dayanabilir. Diğer bir artı nokta, doğrudan plaka üzerinde kullanılıyorsa, koloninin etrafındaki besiyerini renklendirmemesidir.

Kırmızı bir rengin görünümü pozitif bir test olarak yorumlanır.

Oksidaz diskleri

Oksidaz testi için reaktif emdirilmiş ticari disklerdir. Piyasada birçok ticari marka var.

Çalışmayı kolaylaştıran taze reaktifler hazırlamak gerekli olmadığından kullanımı oldukça pratiktir. Elde edilen sonuçlar, diskler uygun şekilde korunduğu sürece güvenilirdir.

Protokoller

Direkt plaka yöntemi, kağıt üzerinde dolaylı yöntem ve oksidaz reaktifleri ile emprenye edilmiş disklerin kullanımı.

-Doğrudan tahta yöntemi

Yukarıda belirtilen reaktiflerin herhangi birinden 2 veya 3 damla, bu amaçla doğrudan glikoz içermeyen bir kültür ortamı plakasında bulunan koloni (ler) üzerine eklenir.

Besiyerinin değil, kolonilerin renk değişimi yorumlanır. Geçerli reaksiyon süresi, kullanılan reaktife bağlıdır.

-Kağıt üzerine dolaylı yöntem

6 sm bir boyuta filtre kağıdı (Whatman No. 1) bir parça kesin ² ve boş bir Petri kabı içine yerleştirin.

Kağıda 2 veya 3 damla Kovacs oksidaz reaktifi ekleyin, çalışılacak koloninin bir kısmını platin sap veya tahta kürdan ile alın ve reaktif emdirilmiş kağıt üzerine düz bir çizgi halinde yayın. 5 ila 10 saniye içinde yorumlayın.

Carpenter, Suhrland ve Morrison reaktifi ile hazırlanan stripler ile kuru strip üzerine bir koloni yayılır. Birkaç suşu test etmek için tek bir şerit kullanılır. 10 saniye içinde yorumlayın

Diskler (m

Ticari diskleri steril damıtılmış suyla hafifçe nemlendirin ve çalışılacak koloninin üzerine koyun. Plakaların 35 ° C'de kullanılması tavsiye edilir, oda sıcaklığında plakalar veya soğutulmuş plakalar kullanılırsa reaksiyon biraz daha yavaştır. 10 ila 20 saniye arasındaki renk değişimini yorumlayın.

Kan veya çikolata agarda bulunan koloniler kullanılabilir.

-Diskler (dolaylı yöntem)

Diski daha önce anlatıldığı gibi nemlendirin. Boş bir Petri kabına koyun. Bir platin sap veya tahta kürdan ile çalışmak için yeterli miktarda koloniyi alın ve diske yerleştirin. 10 ila 20 saniye arasındaki renk değişimini yorumlayın.

Kullanım

Neisseria ve Acinetobacter cinsi bazen morfolojik olarak çok benzerdir, çünkü Acinetobacter cinsi Gram-negatif bir çubuk olmasına rağmen, bazen bir kokoid formu alabilir ve Neisseria cinsini simüle ederek çiftler halinde dağıtılabilir.

Bu durumda oksidaz testi gerçekten faydalıdır. Neisseria cinsi pozitif ve Acinetobacter negatiftir.

Bununla birlikte, Moraxella cinsi Neisseria cinsine çok benzer ve her ikisi de pozitif tepki verir; Bu nedenle, kesin tanımlama için karbonhidrat fermantasyon testleri her zaman yapılmalıdır.

Öte yandan, oksidaz testi, Enterobacteriaceae familyasına (tümü oksidaz negatif) ait bir bakteriyi, Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oksidaz pozitif) cinsi gibi diğer fermenterlerden ayırmak için faydalıdır.

Vibrio ve Helicobacter cinsi de oksidaz pozitiftir.

QA

Negatif kontrol olarak bilinen Escherichia coli suşlarını ve pozitif kontrol olarak Pseudomonas aeruginosa suşlarını kullanın.

Sınırlamalar

-Reaktifler taze hazırlanmış kullanılmalıdır, çözelti içinde oda sıcaklığında raf ömürleri çok kararsız oldukları için kısadır. Buzdolabında 5 gün ila 2 hafta dayanabilirler.

-Reaktifler renksizdir, eğer renk değiştirirlerse atılmalıdırlar. Hasarlı diskler, zamanla koyulaştıkları için ortaya çıkar.

-Kovacs oksidaz reaktifi ile 15-60 saniye arasında pozitif bir reaksiyon gecikmiş bir reaksiyon olarak kabul edilir ve 60 saniye sonra negatif kabul edilmelidir.

-Haemophylus influenzae, dimetil-p-fenilendiamin içeren herhangi bir reaktif kullanılırsa negatif oksidaz reaksiyonu verir, Kovacs oksidaz reaktifi (tetrametil-p-fenilendiamin) kullanılırsa pozitiftir.

-Glikoz içeren ortamlar teste müdahale ederek yanlış negatifler verir.

-Bordetella pertussis suşları, yüksek konsantrasyonlu kanlı agar plaklarından geliyorlarsa yanlış pozitif reaksiyon verebilir.

-Metal (demir) sapların kullanılması yanlış pozitif tepki verir.

tavsiyeler

-Reaktifler çok kararsız olduğundan ve kendi kendine oksitlenme eğiliminde olduğundan, 1 ila 2 ml'lik alikotların dondurulması ve gerektiğinde çıkarılması önerilir.

- Reaktifin oto-oksidasyonunu geciktirmenin başka bir yolu, reaktifleri hazırlarken% 0,1 askorbik asit eklemektir.

-Reaktifler stabil olmadığından haftalık kalite kontrol önerilir.

-Kalite kontrol testini geçemeyen reaktifler kullanılmamalıdır.

Referanslar

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiyolojik Tanı. 5. baskı. Editoryal Panamericana SA Arjantin.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Mikrobiyolojik Tanı. 12 ed. Editoryal Panamericana SA Arjantin.
3. "Oksidaz Testi." Vikipedi, bedava ansiklopedi. 15 Ocak 2018, 10:32 UTC. 3 Nis 2019 günü saat 14:03
4. Dünya Sağlık Örgütü. Gelişmekte Olan Dünyada Halk Sağlığı Önemi Olan Bakteriyel Patojenlerin Antimikrobiyallerine Duyarlılığın Tanımlanması ve Test Edilmesi için Laboratuvar El Kitabı.2004. Bulunduğu yer: who.int/drugresistance/infosharing
5. Bakterilerde oksidaz aktivitesinin teşhisi için reaktif stripleri. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.