SPOR BOYAMA: MANTIK, TEKNIKLER VE KULLANIMLAR - BIYOLOJI - 2024

Spor boyama olumsuz koşullarda bir bakteri cinsi oluşturan dirençli yapıları renklendirmek için kullanılan metodoloji, Bu yapılar bir tür hayatta kalma biçimine karşılık gelir.

Spor oluşturan birçok cins vardır; ancak başlıcaları Bacillus ve Clostridium'dur. Bu cinsler, insanlar için patojenik türlere sahip oldukları için daha alakalı kabul edilir.

Shaeffer - Fulton veya Wirtz-Conklin yöntemi ile spor boyama. Ve tambe (orijinal yükleyici), Wikimedia Commons'tan

Her basil bir spora neden olabilir. Preparatın boyanması sırasında spor basil içinde (endospor) veya dışında (exospor) bulunabilir. Bakteriler için Gram boyama gibi geleneksel boyama teknikleriyle sporlar renksiz kalır.

Şu anda, sporun kalın yapısına nüfuz ederek onu boyayabilen birkaç boyama yöntemi vardır. Bu metodolojiler çok çeşitlidir; Bunlar arasında Dorner tekniği, Möeller boyası ve Wirtz-Conklin olarak da bilinen Shaeffer - Fulton metodolojisi bulunmaktadır.

Bahsedilen tüm teknikler arasında Shaeffer-Fulton metodolojisi, rutin laboratuvarlarda en yaygın kullanılanıdır. 1930'da renklendirmeyi yaratan iki mikrobiyologdan adını almıştır: Alicia Shaeffer ve MacDonald Fulton. Bununla birlikte, teknik bazen 1900'lerden iki bakteriyologdan sonra Wirtz-Conklin olarak adlandırılır.

temel

Sporlar, çok kalın duvarlara sahip oldukları için geleneksel lekelerle lekelenmezler. Sporların karmaşık bileşimi çoğu renklendiricinin girişini engeller.

Spor dışarıdan içe doğru incelendiğinde şu katmanlar gözlenir: İlk olarak, glikoproteinlerin oluşturduğu en ince ve en dış katman olan exosporium vardır.

Daha sonra yüksek sıcaklıklara direnç sağlayan kütikül ve ardından peptidoglikandan oluşan korteks gelir. Daha sonra protoplastı koruyan tabanın duvarı.

Spor,% 15 kalsiyum ve dipikolinik asit içeren susuz bir yapıdır. Bu nedenle, çoğu spor boyama tekniği, boyanın kalın yapıya nüfuz edebilmesi için ısı uygulamasına dayanır.

Spor lekelendikten sonra boyayı çıkaramaz. Shaeffer - Fulton tekniğinde, malakit yeşili vejetatif hücrelere girer ve ısı uygulandığında, ekzosporların yanı sıra endosporlara da nüfuz eder.

Su ile yıkanarak boya vejetatif hücreden uzaklaştırılır. Bu, malakit yeşil boyasının biraz bazik olması nedeniyle oluşur, bu nedenle bitkisel hücreye zayıf bir şekilde bağlanır.

Bunun yerine, spordan çıkamaz ve sonunda basil, safranin ile zıt hale getirilir. Bu temel, benzer bir şeyin meydana geldiği diğer teknikler için geçerlidir.

Spor boyama teknikleri

Spor boyama işlemini gerçekleştirmek için araştırılacak şüpheli suşun saf bir kültürü elde edilmelidir.

Kültür, mikroorganizmanın sporlanmasını uyarmak için 24 saat boyunca aşırı sıcaklıklara tabi tutulur. Bunun için kültür, 24 veya 48 saat 44 ° C'de bir fırına veya bir buzdolabına (8 ° C) yerleştirilebilir.

Belirtilen sıcaklıklarda çok uzun süre bırakılırsa, tüm endosporlar basilden çoktan çıkmış olacağından, yalnızca eksosporlar gözlemlenecektir.

Süre sonunda temiz bir slayt üzerine birkaç damla steril fizyolojik çözelti konulmalıdır. Daha sonra kültürün küçük bir kısmı alınır ve ince bir yayılır.

Daha sonra kurumaya bırakılır, ısıya sabitlenir ve aşağıda açıklanan tekniklerden biri ile boyanır:

Dorner Tekniği

1- Bir test tüpünde sporlanmış mikroorganizmanın damıtılmış suda konsantre bir süspansiyonunu hazırlayın ve eşit hacimde filtrelenmiş Kinyoun carbol fuchsin ekleyin.

2- Tüpü 5 ile 10 dakika arasında kaynar su içeren bir banyoya koyun.

3- Temiz bir slayt üzerinde önceki süspansiyondan bir damla% 10 sulu nigrosin solüsyonu ile karıştırılır, kaynatılır ve süzülür.

4- Hafif ısı ile hızlıca yayın ve kurulayın.

5- 100X objektifle (daldırma) inceleyin.

Sporlar kırmızıyı boyar ve bakteri hücreleri koyu gri bir arka planda neredeyse renksiz görünür.

Modifiye Dorner Tekniği

1- Sporlanan mikroorganizmanın bir süspansiyonu bir slayt üzerine yayılır ve ısıya sabitlenir.

2- Numune karbol fuksin ilave edilen bir filtre kağıdı şeridi ile kapatılır. Renklendirici, buhar oluşumu oluşana kadar Bunsen brülörünün alevi ile 5 ila 7 dakika ısıtılır. Ardından kağıt çıkarılır.

3- Hazırlık su ile yıkanır ve ardından emici kağıt ile kurutulur.

4- Smearı ince bir% 10 nigrosin filmiyle kapatın, nigrosini yaymak için ikinci bir slayt veya bir iğne kullanın.

Sporlar ve bakteriler tarafından alınan renklendirme, önceki teknikte açıklananla aynıdır.

Shaeffer - Fulton veya Wirtz-Conklin tekniği

1- Bir slayt üzerinde sporlanmış mikroorganizma süspansiyonu ile ince bir yayma yapın ve ısıya sabitleyin.

2- Slaytı% 5 malakit yeşili sulu çözelti ile kapatın (slayt üzerine filtre kağıdı koyabilirsiniz).

3- Bunsen brülörünün alevi üzerinden ısıtarak buharların dışarı çıkmasını sağlayın ve alevi uzaklaştırın. İşlemi 6 ila 10 dakika tekrarlayın. Malakit yeşil solüsyon işlem sırasında çok fazla buharlaşırsa daha fazlası eklenebilir.

4- Filtre kağıdını (takılıysa) çıkarın ve suyla yıkayın.

5- Slaytı 30 saniye boyunca% 0.5 sulu safranin ile kapatın (tekniğin bazı varyantları% 0.1 sulu safranin kullanır ve 3 dakika bekletin).

Bu teknikle sporlar yeşil ve basiller kırmızı görünür.

Genç kültürlerin endosporlarının son derece berrak veya renksiz görünmeleri nedeniyle iyi lekelenmemesi dezavantajına sahiptir. Bundan kaçınmak için 48 saatlik inkübasyon kültürlerinin kullanılması önerilir.

Möeller tekniği

1- Sürüntüyü 2 dakika kloroform ile kapatın.

2- Kloroformu atın.

3-% 5 kromik asit ile 5 dakika örtün.

4- Distile su ile yıkayın

5- Levha carbol fuchsin-fenicada ile kaplanır ve buhar çıkıncaya kadar Bunsen ocağının alevine maruz bırakılır; daha sonra birkaç dakika alevden çıkarılır. İşlem 10 dakika tamamlanana kadar tekrar edilir.

6- Su ile yıkayın.

7- Renk değiştirmek için asitlendirilmiş etanol (hidroklorik alkol) kullanın. 20 veya 30 saniye bırakılır.

8- Distile su ile yıkayın.

9- Levha metilen mavisi ile 5 dakika kapatılarak kontrastlanır.

10- Distile su ile yıkayın.

11- Kurumaya bırakılır ve numune mikroskoba alınır.

Sporlar kırmızı ve basil mavisi görünür. Toksik oldukları ve uzun vadede kanserojen olabileceği için buharları solumamak önemlidir.

Isı olmadan modifiye edilmiş Möeller tekniği

2007'de Hayama ve ortakları, Möeller tekniğinin bir modifikasyonunu yarattı. Boyayı ısıtma adımını ortadan kaldırdılar ve her 10 ml karbol fuksin-karbol çözeltisi için 2 damla yüzey aktif madde Tergitol 7 ekleyerek değiştirdiler. Aynı sonuçlar elde edildi.

Uygulamalar

Sporların boyanması, patojenin tanımlanması için çok değerli ve faydalı bilgiler sağlar, çünkü varlığı, şekli, basil içindeki yeri ve vejetatif hücreyi deforme edip etmeme yeteneği türlere rehberlik edebilecek verilerdir. belirli bir tür içinde yer alır.

Bu bağlamda, sporların yuvarlak veya oval olabileceğini, merkezde veya ayrıca parasantral, subminal veya terminal pozisyonda yer alabileceklerini söylemeye değer.

Endosporların ve eksosporların şekil ve konumunun şeması

Örnekler

- Clostridium difficile, basili deforme eden terminal pozisyonda oval bir spor oluşturur.

- Clostridium tertium'un sporu ovaldir, basili deforme etmez ve terminal seviyesinde bulunur.

- Clostridium tetani'nin endosporu terminaldir ve basili deforme ederek bir baget görünümü verir.

- Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy ve C. septicum sporları yuvarlak veya subterminal ovaldir ve basili deforme eder.

- Clostridium sordelli'nin endosporu, hafif bir deformasyonla orta konumda bulunur.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiyolojik Tanı. (5. baskı). Arjantin, Editoryal Panamericana SA

Referanslar

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Isı uygulamadan bakteriyel sporları boyamak için basitleştirilmiş bir teknik önerisi - Moeller yönteminin başarılı modifikasyonu. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Wikipedia'ya katkıda bulunanlar. Moeller lekesi. Vikipedi, bedava ansiklopedi. 3 Kasım 2018 03:28 UTC. Şu adresten ulaşılabilir: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Mikrobiyolojik Teknikler Laboratuvar Kılavuzu. Mikrobiyoloji Akademisi Temel Bilimler Bölümü. Ulusal Politeknik Enstitüsü.
4. "Endospor." Vikipedi, bedava ansiklopedi. 25 Şubat 2018, 10:20 UTC. 10 Ocak 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J ve işbirlikçileri. (2006). Özerk Extremadura topluluğunun İşçi Personeli. Özel gündem Cilt IV. Editoryal MAD. Seville-İspanya, s. 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006) Laboratuvar teknisyeni uzmanı, Galician Health Service (SERGAS). Özel konu gündem cilt 2. Editoryal MAD. Seville-İspanya, s. 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiyolojik Tanı. (5. baskı). Arjantin, Editoryal Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Arjantin. Editoryal Panamericana SA