WRIGHT'IN LEKESI: MANTIK, MALZEME, TEKNIK VE KULLANIMLAR - BIYOLOJI - 2025

Wright leke Romanowsky soya dayalı 1902 yılında Amerikan patolog James Homer Wright tarafından oluşturulan bir boyama tekniğidir. Romanowsky boyası stabil olmadığından, Wright metanolü bir çözücü ve sabitleyici olarak dahil etti.

Bu renklendirme polikromatiktir, yani boyayı emen yapıya bağlı olarak birkaç renk oluşturduğu anlamına gelir. Bu boyama tekniği, farklı beyaz kan hücresi sayımlarını gerçekleştirmek ve periferik kan ve kemik iliğindeki kırmızı kan hücreleri, trombositler ve lökositlerin morfolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Wright'ın lekesiyle çeşitli periferik kan lekeleri boyandı. A. Akut lösemi B. Eritrosit içindeki plasmodyum vivax. C. Plasmodium falciparum, macrogametocyte. D. Lenfosit

Kanın farklı hücre dizilerinde anormallikler görülebildiğinden lösemi gibi hastalıkların veya bakteriyel veya paraziter enfeksiyonların teşhisini kolaylaştırdığı için uygulaması çok önemlidir.

Belki de bunlar, bu tekniğin kullanıldığı en yaygın uygulamalardır, ancak sadece bunlar değildir. Ayrıca burun akıntısı, dışkı mukusu, balgam, deri örnekleri gibi kan ve kemik iliği dışındaki örneklerde de faydalıdır.

Wright'ın lekesinin gerekçesi

Wright'ın lekesi, asidik bir boya (eozin Y) ve bazik bir boyadan (metilen mavisi) oluşan bir metil alkol çözeltisi ve bunların oksidasyon ürünlerinden oluşan Romanowsky'nin boyasından doğdu.

Wright'ın boyasında kullanılan boyaların karışımı Romanowsky olarak bilinen etkiye neden olur, yani lökosit ve nötrofilik granüllerin çekirdeklerine güzel bir mor renk verirken, kırmızı kan hücreleri pembeye boyanır.

Wright boyasının tipik renk gamını vermekten sorumlu bileşenler mavi B ve eozin Y'dir. Gözlemlenen etki, boyaların kimyasal yapılara bağlanmasına ve mavi B ile eozin Y'nin etkileşimlerine bağlı olacaktır.

Nükleik asitler, nükleer proteinler ve bazı hücre tiplerinin reaktif olgunlaşmamış sitoplazması gibi asidik yapılar, mavi B'yi (temel leke) sabitler.

Hemoglobin gibi temel yapılar, diğer hücresel yapıların yanı sıra, segmentli eozinofillerin granülleri eozin Y'yi (asit boya) bağlar.

Boyama sonucu, Wright boyasının pH'ı, tampon ve yıkama çözeltisi gibi farklı faktörlerden etkilenebilir; yanı sıra boyama ve fiksasyon süresi.

Bu nedenle, reaktiflerin hazırlanmasındaki her adım çok önemlidir ve her ayrıntıya dikkat edilerek gerçekleştirilmelidir.

malzemeler

Wright'ın lekesi. 100 mL için şu gereklidir:

0.3 g Wright's boyasını tartın, 97 ml metanol ve 3 ml gliserol ölçün.

Hazırlık

Ağır miktarda Wright boyasını bir havana yerleştirin ve toz tamamen çözülene kadar yavaş yavaş gliserol ekleyin.

Ardından metanol eklenir, karıştırılır ve amber renkli bir şişeye dökülür.

Kullanmadan önce çözelti hafif hareketlerle çalkalanmalı ve süzülmelidir.

Tamponlu tampon çözelti

Damıtılmış su bir litre olarak disodyum hidrofosfat 3.76 gr (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) artı dihidrojen potasyum fosfat (KH 2.1 gr ₂ PO ₄ ) ilave edilir.

Dahil edilen tüm reaktifler çözülene kadar çok iyi karıştırın. PH'ı 7.2'ye ayarlayın. Bir cam kavanoza dökün ve oda sıcaklığında tutun.

Renklendirmeyi gerçekleştirmek için gereken ek malzemeler

Ek olarak, renklendirme tekniğini uygulayabilmek için başka malzemeler gereklidir, bunlar: nesne kaydırır veya nesneleri örter, renklendirme köprüsü, yıkama için su veya tamponlu tişörtler, renklendirme sürelerini korumak için bir zamanlayıcı ve bazı kurutma malzemeleri (emici kağıt, gazlı bez veya pamuk).

Wright boyasının bileşenleri

Metanol

Alkol (metanol), slayda kan yaymasının bir fiksatifi olarak hizmet eder.

Temelde bir pıhtılaştırıcı indirgeyici, dehidre edici ve sabitleyici reaktiftir. Bu nedenle, işlevi proteinleri pıhtılaştırmak ve onları çözünmez hale getirmektir, ancak aslında onları denatüre etmeden.

Metanol, etanolden daha iyi sonuçlar verdiği için tüm laboratuvarlarda en yaygın kullanılan smear fiksasyon reaktifidir. İdeal konsantrasyon% 99'dur.

Damper

Tampon (tamponlu çözelti), boyanın pH'ını ayarlama veya koruma işlevine sahiptir, çünkü 7.2'ye ayarlanmış bir pH, hücre yapılarının boyaları düzgün şekilde emebilmesi için gereklidir.

Öte yandan, metanol fiksasyon adımı hücreleri kurutur ve tampon, hücrelerin yeniden hidratlanmasına yardımcı olur.

Eozin (Y)

Eozin, bir asit boyası olduğu için yapı taşlarına afinitesine sahiptir. İki tür eozin birbirine çok benzer olarak bilinir, o kadar ki ikisinden biri kullanılabilir ve aynı sonucu elde eder.

Biri eozin Y, sarı eozin veya tetrabromofloresein olarak adlandırılırken diğeri eozin B, mavimsi eritrosin B veya dibromodinitrofloresein olarak adlandırılır. Bununla birlikte, eozin Y en yaygın kullanılanıdır.

Bu boyanın en önemli özelliği negatif polaritesidir, bu da onu pozitif yüklü hücre yapılarına çekmesini sağlar.

Metilen mavisi

Temel renklendirmedir. Başlıca özelliği metakromazidir, yani tüm yapılar aynı renkte boyanmayacaktır, renklendirilen yapıların kimyasal bileşimine bağlıdır.

Bazıları açık veya koyu maviye, bazıları koyu mor veya soluk leylak rengine dönecektir.

Teknik

1-Numuneyi ince bir film kalacak şekilde slayt veya lamel üzerinde dağıtın.

2-Yaklaşık 2 saat havada kurumasını bekleyin.

3-Kuru sürüntüyü, numunenin yayılması yukarı bakacak şekilde boyama köprüsüne veya boyama tepsisine yerleştirin.

4-Sayfayı Wright lekesiyle tüm yüzey kaplanana kadar damla damla örtün. 5-8 dakika bekletin.

5-Leke, kenarlara dökülmeden slaytı tamamen örtmelidir. Renklendirme süresi boyunca buharlaşmaya başlarsa, birkaç damla daha ekleyin.

6-Ardından eşit miktarda amortisör ekleyin, karakteristik metalik parlaklık görünene kadar biraz üfleyin. 10 ila 15 dakika arası.

7-Musluk suyuyla yıkayın, pembeleşene kadar yumuşak akışı yerleştirin.

8-Alkole batırılmış bir gazlı bezle slaydın arkasına yapışan boyayı çıkarın.

9-Daldırma yağı yerleştirmeden önce smearın iyice kurumasını bekleyiniz ve mikroskop altında görüntüleyiniz.

Yarar

Hematoloji

Periferik kan yaymalarının boyanması, kalın kan yaymalarının incelenmesi ve kemik iliği örneklerinden alınan hücrelerin incelenmesi için idealdir.

Bu boya kombinasyonunun kimyasal özellikleri nedeniyle, hücre yapıları kolayca tanınabilir ve mevcut farklı hücre türleri ayırt edilebilir.

Burun akması

Bu teknik, alerjik rinit tanısında nazal akıntı hücrelerini (epitel hücreleri, segmentlere ayrılmış eozinofiller, polimorfonükleer hücreler) tanımlamak için çok faydalıdır.

parazitoloji

Bu anlamda, deri ülserlerinde deri altı hücresel dokunun histiyositlerinde Leishmania sp'nin incelenmesi için yararlı olmuştur. Aynı şekilde dışkı örneklerinde (dışkı lökogram) lökositleri tanımlamak için kullanılır.

Bu durumda, dışkıda bulunan lökositozun polimorfonükleer mi yoksa mononükleer mi olduğunu bilmek hekimin ilgisini çeker. Dışkı lökogramındaki bu bulgu, sırasıyla bakteriyel mi yoksa viral bir enfeksiyon mu olduğuna rehberlik edecektir.

Öte yandan, kanda dolaşan parazitler eritrosit içinde bulunabilir veya plazmada serbest olabilir. Aranan parazitler, Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii ve filarias olup, veteriner hekimlikte, özellikle atlarda, bebesiosis'e neden olan Theileria equi ve Babesia caballi'nin araştırılmasında yararlıdır.

Wright boyası ve ayrıca Giemsa boyası, hemoparazitleri normal hücresel bileşenlerden ayırmayı mümkün kılar. Bunun için iki tür spread kullanılabilir:

İnce yayıldı

Kan, slayt üzerine ince bir film halinde yayılır. Çekirdek ve sitoplazmanın özelliklerini ortaya çıkaran Wright boyası ile boyanmıştır.

Kalın damla

Bu metodoloji, daha büyük miktarda kandaki parazitlerin varlığını araştırmak için kullanılır.

Bunu yapmak için, bir slayta büyük bir damla kan yerleştirilir. Oraya vardığında, başka bir slaydın kenarını kullanarak merkezden dışarıya doğru gittikçe daha büyük daireler çizerek defibrilasyonu yapılmalıdır.

Son olarak, kalın yaymadaki parazitleri görebilmek için eritrositlerin su ile parçalanması gerekir.

Solunum yolu enfeksiyonları

Solunum düzeyinde, bu teknik de yararlıdır çünkü balgam, bronşiyal lavaj veya bronkoalveolar örneklerinde bulunan hücreler tanıyı koymak için önemlidir.

Benzer şekilde, polimorfonükleer hücreler ve mononükleer hücreler burada ayırt edilebilir.

Bakteriyoloji

Bu tekniğin bakteriyolojide kullanımı sınırlıdır, çünkü bakterileri boyamak için iyi değildir, bu yüzden boyama için diğer özel boyama teknikleri kullanılır.

Bununla birlikte, üretral veya endoservikal mukoza yaymalarında Chlamydia trachomatis inklüzyon cisimcikleri içeren epitel hücrelerini aramak için kullanılmıştır, ancak bunun için en iyi yöntem olmadığı bilinmelidir.

Enfekte hastalarda kırmızı kan hücreleri arasında Borrelia burgdorferi gibi spiral benzeri bakterilerin yanı sıra bir kan yaymasındaki lenfositler, monositler veya nötrofillerin sitoplazmasında Ehrlichia sp'nin morulaları veya inklüzyon cisimcikleri de gözlemlenebilir.

Mikoloji

Histoplasma capsulatum, Wright boyası ile boyanan çeşitli doku örneklerinin mikroskobik gözlemiyle sıklıkla teşhis edilen patojenik bir mantardır.

Wright'ın boyasıyla kan örneğinin yapısı nasıl gözlenir?

Kaynak: Retamales E, Mazo V. Halk Sağlığı Enstitüsü, Şili Hükümeti. Hemogramın okunması için kan yaymalarının boyanması için öneriler.

İyi boyama için öneriler

Kan örneği slaytları kendiliğinden kurumaya bırakılmalıdır. Boyanın daha iyi sabitlenmesini sağlamak ve aşırı lekelenmeyi önlemek için lekeler olabildiğince ince olmalıdır.

Yüksek kaliteli boyama için, smear hazırlandıktan sonra iki saat içinde boyamanız önerilir. Öte yandan, ideal örnek antikoagülan içermeyen kılcal kandır.

Bununla birlikte, venöz kan kullanılıyorsa, heparin değil, antikoagülan EDTA olarak kullanılmalıdır çünkü ikincisi hücre yapılarını deforme edebilir.

Hazırlanan renklendiricinin bozulmaması için kuru yerlerde saklanmalıdır.

Yıkama işlemi sırasında nötr pH'a ayarlanmış su kullanılması tavsiye edilir.

Son olarak, laboratuvarda kullanılan boyama yöntemlerinin zaman zaman test edilmesi tavsiye edilir.

Bu, kalite kontrol olarak numuneler veya genişletilmiş desenler boyanarak yapılır. Bu adım, boyamanın uygun şekilde hazırlanmasını ve boyama sürelerinin iyi bir şekilde standardize edilmesini sağladığı için önemlidir.

Desen sayfası kötü renklendirilmişse, çözülmesi gereken sorunlar vardır.

Wright boyamasında yaygın hatalar

Çok soluk boyama

Çok soluk lekeler genellikle çok kısa boyama süresinden veya aşırı yıkamadan kaynaklanır. Boya ile temas süresi uzatılarak veya yıkama süresi azaltılarak düzeltilir.

Renklendirici çökelir

Yaymada boya çökeltilerinin varlığının birkaç nedeni olabilir, ancak en sık nedenler şunlardır: filtrelenmemiş boya kullanımı, eşit olmayan lekelenme köprülerinde lekelenme, toz veya gresle kirli tabakalar kullanma, iyi yıkamama tam boyama.

Aşırı derecede kırmızı veya mavi leke

Tampon, boyanın pH'ından sorumludur. Belirtilenin altında (asidik) pH değerine sahip boyalar çok kırmızımsı lekelere neden olur.

Boyanın pH'ı (alkali) üzerindeyse, son derece mavimsi bir leke elde edilecektir.

Depolama modu

Reaktif oda sıcaklığında saklanmalıdır.

Referanslar

1. Gutiérrez V. Honduras, San Pedro Sula şehrinde köpek Ehrlichiosis teşhisi için Wright boyama yöntemi ve Elisa testi arasında karşılaştırmalı çalışma. 2008. Veteriner Hekimliği Derecesine hak kazanmak için Tez Derecesi. Guatemala San Carlos Üniversitesi.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Mikrobiyoloji laboratuvarında temel boyalar. Engellilik Araştırması. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Wright'ın lekesi." Vikipedi, bedava ansiklopedi. 18 Mayıs 2018, 12:05 UTC. 8 Ara 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Babesia spp sıklığı. avcılıkta, Córdoba (Kolombiya). Rev. udcaactual ifşa. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey & Scott Mikrobiyolojik Tanı. 12 ed. Arjantin. Editoryal Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Şili Hükümeti Halk Sağlığı Enstitüsü. Hemogramın okunması için kan yaymalarının boyanması için öneriler.