ENDONÜKLEAZLAR: FONKSIYONLAR, TÜRLER VE ÖRNEKLER - BIYOLOJI - 2025

Endonükleaz nükleotid zinciri içinde yer alan fosfodiester bağları kesmek enzimlerdir. Endonükleaz kısıtlama siteleri oldukça çeşitlidir. Bu enzimlerin bir kısmı DNA'yı (deoksiribonükleik asit, genetik materyalimiz) hemen hemen her yerde keser, yani spesifik değildirler.

Tersine, bölünecek bölge veya dizide çok spesifik olan başka bir endonükleaz grubu vardır. Bu enzim grubu, kısıtlama enzimleri olarak bilinir ve moleküler biyolojide çok faydalıdır. Bu grupta iyi bilinen Bam HI, Eco RI ve Alu I enzimlerimiz var.

Endonükleazlar DNA'yı dahili olarak keser.
Kaynak: Pixabay.com

Endonükleazların aksine, zincirin sonundaki fosfodiester bağlarını kırmaktan sorumlu olan başka bir katalitik protein türü (eksonükleazlar) vardır.

Kısıtlama endonükleazları

Kısıtlama endonükleazları veya kısıtlama enzimleri, çok spesifik dizilerde DNA zinciri içindeki fosfodiester bağlarının bölünmesinden sorumlu olan katalitik proteinlerdir.

Bu enzimler, birçok biyoteknoloji şirketinden satın alınabilir ve bunların kullanımı, mevcut DNA manipülasyon tekniklerinde neredeyse gereklidir.

Kısıtlama endonükleazları, geldikleri organizmanın iki terimli bilimsel adının ilk harfleri kullanılarak adlandırılır, ardından tür (bu isteğe bağlıdır) ve ait oldukları kısıtlama enzimleri grubuyla biter. Örneğin Bam HI ve Eco RI, yaygın olarak kullanılan endonükleazlardır.

Enzimin tanıdığı DNA bölgesi, kısıtlama bölgesi olarak adlandırılır ve her bir endonükleaz için benzersizdir, ancak birkaç enzim, kısıtlama bölgelerinde çakışabilir. Bu site genellikle, AGCT (Alu I için) ve Eco RI için GAATTC gibi yaklaşık 4 ila 6 baz çifti uzunluğunda kısa bir palindromik diziden oluşur.

Palindromik diziler, 5 'ila 3' veya 3 'ila 5' yönünde okunmasına rağmen aynı olan dizilerdir. Örneğin, Eco RI durumunda, palindromik dizi: GAATTC ve CTTAAG'dir.

Kısıtlama endonüküllerinin işlevleri ve uygulamaları

Neyse ki moleküler biyologlar için, bakteriler evrim sırasında genetik materyali dahili olarak parçalayan bir dizi kısıtlama endonükleazı geliştirdiler.

Doğada, bu enzimler muhtemelen - fajlardan gelenler gibi yabancı DNA moleküllerinin istilasına karşı bir bakteri koruma sistemi olarak evrimleşmiştir.

Doğal ve yabancı genetik materyal arasında ayrım yapmak için, bu kısıtlama endonükleazları spesifik nükleotid sekanslarını tanıyabilir. Böylece, bu diziye sahip olmayan DNA, bakteri içinde bozulmadan kalabilir.

Tersine, endonükleaz kısıtlama bölgesini tanıdığında, DNA'ya bağlanır ve onu keser.

Biyologlar, canlıların genetik materyallerini incelemekle ilgileniyorlar. Bununla birlikte, DNA birkaç milyon baz çiftinden oluşur. Bu moleküller son derece uzundur ve küçük parçalar halinde analiz edilmelidir.

Bu hedefi karşılamak için, kısıtlama endonükleazları çeşitli moleküler biyoloji protokollerine entegre edilmiştir. Örneğin, gelecekteki analizler için ayrı bir gen yakalanabilir ve kopyalanabilir. Bu işleme bir genin "klonlanması" denir.

Kısıtlama parçası uzunluğu polimorfizmi (RFLP)

Kısıtlama fragmanı uzunluk polimorfizmleri, kısıtlama endonükleazlarının tanıyabildiği ve kesebildiği DNA'daki spesifik nükleotid sekanslarının modeline karşılık gelir.

Enzimlerin özgüllüğü sayesinde, her organizma, DNA'da çeşitli uzunluklarda fragmanlardan kaynaklanan belirli bir kesim modeli ile karakterize edilir.

Kısıtlama endonükleaz türleri

Tarihsel olarak, kısıtlama endonükleazları, Roma rakamları ile gösterilen üç tip enzim olarak sınıflandırılmıştır. Son zamanlarda, dördüncü bir endonükleaz türü tarif edilmiştir.

İ harfini yaz

Tip I endonükleazların en önemli özelliği, birkaç alt birimden oluşan proteinler olmalarıdır. Bunların her biri tek bir protein kompleksi olarak işlev görür ve genellikle R, iki M ve bir S olarak adlandırılan iki alt birime sahiptir.

S kısmı, DNA'daki kısıtlama bölgesinin tanınmasından sorumludur. R alt birimi parçalanma için gereklidir ve M metilasyon reaksiyonunu katalize etmekten sorumludur.

Yaygın olarak kullanılan, A, B, C ve D harfleriyle bilinen tip I enzimlerinin dört alt kategorisi vardır. Bu sınıflandırma, genetik tamamlamaya dayanmaktadır.

Tip I enzimler, keşfedilen ve saflaştırılan ilk kısıtlama endonükleazlarıydı. Bununla birlikte, moleküler biyolojide en yararlı olanı, bir sonraki bölümde anlatılacak olan tip II'dir.

Tip II

Tip II kısıtlama endonükleazları, spesifik DNA dizilerini tanır ve 5 'fosfat ve 3' hidroksil üreten bir diziye yakın sabit bir pozisyonda bölünür. Genellikle kofaktör olarak magnezyum iyonlarına (Mg2 ⁺ ) ihtiyaç duyarlar , ancak çok daha özel gereksinimleri olan bazıları da vardır.

Yapısal olarak monomerler, dimerler ve hatta tetramerler olarak görünebilirler. Rekombinant teknoloji tip II endonükleazları kullanır ve bu nedenle 3,500'den fazla enzim karakterize edilmiştir.

Tip III

Bu enzimatik sistemler, DNA'yı tanıyan alt birimleri ve modifikasyonları veya kısıtlamaları kodlayan mod ve res adı verilen iki genden oluşur. Her iki alt birim de, tamamen ATP hidrolizine bağlı bir süreç olan kısıtlama için gereklidir.

DNA molekülünü yarmak için, enzim palindromik olmayan tanıma dizisinin iki kopyası ile etkileşime girmeli ve bölgeler, substrat üzerinde ters yönde olmalıdır. Bölünmeden önce bir DNA translokasyonu gelir.

Tip IV

Son zamanlarda ek bir grup belirlendi. Sistem, metillenmiş, hidroksimetillenmiş veya hidrometillenmiş glukozil olmak üzere yalnızca modifiye edilmiş DNA sekanslarını bölen proteinleri kodlayan iki veya daha fazla genden oluşur.

Örneğin, EckKMcrBC enzimi genel RmC formundaki iki dinükleotidi tanır; bir purin ve ardından metillenmiş bir sitozin, 40'dan neredeyse 3000'e kadar birkaç baz çifti ile ayrılabilir. Bölünme, enzimin tanıdığı bölgeden yaklaşık 30 baz çifti sonra gerçekleşir.

Endonükleazlar tip V

Bu tipte endonükleazlar, "homing" endonükleazlar olarak da bilinir. Bu enzimler, hedef DNA dizisini genomdaki benzersiz bölgelerde 14 ila 40 bp arasında tanır ve keser.

Bu enzimler genellikle intronlarda kodlanır ve işlevlerinin kesik dizilerin yatay transferini teşvik ettiğine inanılır. Kesildikten sonra, tamamlayıcı diziye bağlı olarak DNA çift sarmalında bir kırılma onarımı gerçekleşir.

Örnekler

E. coli'den Endonükleaz I, faj ve parazitlere karşı bir savunma sistemi görevi görür. Esas olarak sitoplazmik membran ve hücre duvarı arasında bulunur. Periplazmik boşlukta etkileşime girdiği yabancı DNA'da çift sarmallı kırılmalar üretir.

CRISPR-Cas endonükleazlar, birçok bakteri türünün savunma mekanizmasına etki eden enzimlerdir. Bunlar, genellikle virüs olan istilacı organizmalardan spesifik DNA dizilerini tanımlar ve keser.

Son zamanlarda, Massachusetts Teknoloji Enstitüsü'ndeki (MIT) araştırmacılar, CRISPR-Cas12bm genom düzenleme sistemini insan hücrelerinin modifikasyonu için yüksek hassasiyetle keşfettiler.

Referanslar

1. Burrell, MM (Ed.). (1993). Moleküler biyolojinin enzimleri. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA ve Wilson, GG (2013). Tip I restriksiyon enzimleri ve akrabaları. Nükleik asit araştırması, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS ve Pfaller, MA (2017). Tıbbi Mikrobiyoloji + Öğrenci Danışmanı İspanyolca + Öğrenci Danışmanı. Elsevier Sağlık Bilimleri.
4. Nathans, D. ve Smith, HO (1975). DNA moleküllerinin analizi ve yeniden yapılandırılmasında kısıtlama endonükleazları. Biyokimyanın yıllık incelemesi, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ve Wende, W. (2005). Tip II kısıtlama endonükleazları: yapı ve mekanizma. Hücresel ve moleküler yaşam bilimleri, 62 (6), 685.