KISITLAMA ENZIMLERI: FONKSIYONLAR, TÜRLER VE ÖRNEKLER - BIYOLOJI - 2025

Sınırlama enzimleri inhibe ya da içinde virüslerin yayılmasını "kısıtlayabilir", belirli arke ve bakteriler tarafından kullanılan endonükleazlan. Özellikle bakterilerde yaygındır ve kısıtlama / modifikasyon sistemi olarak bilinen yabancı DNA'ya karşı savunma sistemlerinin bir parçasıdır.

Bu enzimler, çift bantlı DNA'nın belirli yerlerde bölünmesini, tekrarlanabilir şekilde ve ek enerji kullanmadan katalize eder. Çoğu, magnezyum veya diğer iki değerlikli katyonlar gibi kofaktörlerin varlığını gerektirir, ancak bazıları ayrıca ATP veya S-adenosil metiyonin gerektirir.

HindIII kısıtlama enzim reaksiyon şeması (Kaynak: Helixitta, Wikimedia Commons)

Kısıtlama endonükleazları, 1978'de, keşiflerinden dolayı tıpta Nobel Ödülü alan Daniel Nathans, Arber Werner ve Hamilton Smith tarafından keşfedildi. İsimleri genellikle ilk gözlemlendikleri organizmadan gelmektedir.

Bu tür enzimler, DNA klonlama yöntemlerinin ve diğer moleküler biyoloji ve genetik mühendisliği stratejilerinin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Spesifik dizi tanıma özellikleri ve tanıma alanlarına yakın dizileri kesme yetenekleri, onları genetik deneylerde güçlü araçlar haline getirir.

Belirli bir DNA molekülü üzerinde etkili olan kısıtlama enzimleri tarafından üretilen fragmanlar, enzimin DNA'yı kestiği bölgeler hakkındaki bilgileri kullanarak orijinal molekülün bir "haritasını" yeniden oluşturmak için kullanılabilir.

Bazı kısıtlama enzimleri, DNA üzerinde aynı tanıma bölgesine sahip olabilirler, ancak onları aynı şekilde kesmeleri gerekmez. Dolayısıyla, moleküler biyolojide farklı uygulamaları olan, künt uçları kesen enzimler ve kohezif uçları kesen enzimler vardır.

Şu anda, farklı ticari evler tarafından sunulan, ticari olarak temin edilebilen yüzlerce farklı kısıtlama enzimi vardır; Bu enzimler, farklı amaçlar için "özel" moleküler makas görevi görür.

Özellikleri

Kısıtlama enzimleri, bir nükleotid zincirindeki bitişik nükleotidler arasındaki fosfodiester bağı içindeki ester bağını hidrolize ettikleri veya kırdıkları için polimerazların zıt işlevini yerine getirirler.

Moleküler biyoloji ve genetik mühendisliğinde, ekspresyon ve klonlama vektörlerinin yapılandırılmasında ve ayrıca spesifik dizilerin tanımlanmasında yaygın olarak kullanılan araçlardır. Aynı zamanda rekombinant genomların inşası için de faydalıdırlar ve büyük biyoteknolojik potansiyele sahiptirler.

Gen terapisindeki son gelişmeler, belirli genlerin, bu tür genlerin canlı hücrelere taşınması için araçlar olan ve muhtemelen gerçekleştirmek için hücresel genoma girme kabiliyetine sahip olan vektörlere sokulması için kısıtlama enzimlerinin mevcut kullanımını yapmaktadır. kalıcı değişiklikler.

Hareket mekanizması

Kısıtlama enzimleri, çift bantlı DNA bölünmesini katalize edebilir, ancak bazıları tek bantlı DNA dizilerini ve hatta RNA'yı tanıyabilir. Kesim, dizilerin tanınmasından sonra gerçekleşir.

Etki mekanizması, her DNA zincirinin iskeletindeki bir fosfat grubu ile bir deoksiriboz arasındaki fosfodiester bağının hidrolizinden oluşur. Enzimlerin çoğu, tanıdıkları aynı yerde kesebilirken, diğerleri ondan önce veya sonra 5 ila 9 baz çifti kesebilir.

Normalde bu enzimler, fosfat grubunun 5 'ucunda kesilerek 5' fosforil ucu ve 3 'terminal hidroksil ucu olan DNA fragmanlarına yol açar.

Proteinler, DNA'daki tanıma bölgesi ile doğrudan temas etmediklerinden, spesifik bölge elde edilene kadar, belki de DNA ipliği üzerindeki "kayan" mekanizmalar aracılığıyla, art arda yer değiştirmeleri gerekir.

Enzimatik bölünme sırasında, DNA zincirlerinin her birinin fosfodiester bağı, kısıtlama enzimlerinin aktif bölgelerinden biri içinde konumlandırılır. Enzim tanıma ve bölünme bölgesini terk ettiğinde, bunu spesifik olmayan geçici ilişkiler yoluyla yapar.

Türleri

Şu anda beş tip kısıtlama enzimi bilinmektedir. İşte her birinin kısa bir açıklaması:

Tip I kısıtlama enzimleri

Bu enzimler, biri kısıtlama, biri metilasyon ve diğeri DNA'da sekans tanıma için olmak üzere üç alt birimi olan büyük pentamerik proteinlerdir. Bu endonükleazlar, kısıtlama ve modifikasyon reaksiyonlarını katalize edebilen çok işlevli proteinlerdir, ATPaz aktivitesine ve ayrıca DNA topoizomerazına sahiptirler.

Bu tür enzimler, keşfedilen ilk endonükleazlardı, ilk olarak 1960'larda saflaştırıldılar ve o zamandan beri derinlemesine çalışıldılar.

Tip I enzimler, biyoteknolojik bir araç olarak yaygın bir şekilde kullanılmamaktadır, çünkü bölünme bölgesi, tanıma bölgesinden 1.000 baz çiftine kadar değişken bir mesafede olabilmekte, bu da onları deneysel tekrarlanabilirlik açısından güvenilmez kılmaktadır.

Tip II kısıtlama enzimleri

DNA'yı 4 ila 8 bp uzunlukta belirli yerlerde kesen homodimerlerden veya tetramerlerden oluşan enzimlerdir. Bu bölünme siteleri tipik olarak palindromiktir, yani her iki yönde de aynı şekilde okunan dizileri tanırlar.

Bakterilerdeki tip II kısıtlama enzimlerinin çoğu, kendi DNA'sında olması gereken tipik modifikasyonlara sahip olmadığından, yabancı karakterini tanıdıklarında DNA'yı keser.

Bunlar, DNA dizilerini tanımak ve kesmek için magnezyum (Mg +) dışında herhangi bir kofaktör gerektirmediğinden en basit kısıtlama enzimleridir.

Tip II kısıtlama enzimlerinin DNA'daki basit dizileri kesin konumlarda tanıma ve kesmedeki hassasiyeti, onları moleküler biyolojinin çoğu dalında en yaygın kullanılan ve vazgeçilmez kılar.

Tip II kısıtlama enzimleri grubu içinde, her biri için benzersiz olan belirli özelliklere göre sınıflandırılmış çok sayıda alt sınıf vardır. Bu enzimlerin sınıflandırılması, enzimin isminden sonra A'dan Z'ye alfabenin harfleri eklenerek yapılır.

Kullanışlılıkları ile en iyi bilinen alt sınıflardan bazıları şunlardır:

Alt sınıf IIA

Farklı alt birimlerin dimerleridir. Asimetrik dizileri tanırlar ve kesme enzimlerinin üretimi için ideal öncüler olarak kullanılırlar.

Alt sınıf IIB

Bir veya daha fazla dimerlerden oluşurlar ve tanıma dizisinin her iki tarafında DNA'yı keserler. Her iki DNA ipliğini de tanıma bölgesinin önünde bir baz çifti aralığı kesiyorlar.

Alt sınıf IIC

Bu tür enzimler, DNA ipliklerinin bölünmesi ve modifikasyonu işlevlerine sahip polipeptitlerdir. Bu enzimler her iki ipi de asimetrik olarak keser.

Alt sınıf IIE

Bu alt sınıfın enzimleri, genetik mühendisliğinde en çok kullanılanlardır. Katalitik bir bölgeye sahiptirler ve genellikle bir allosterik efektör gerektirirler. Bu enzimlerin, verimli bölünme gerçekleştirmek için tanıma dizilerinin iki kopyasıyla etkileşime girmesi gerekir. Bu alt sınıfta EcoRII ve EcoRI enzimleri bulunur.

Tip III kısıtlama enzimleri

Tip III kısıtlama endonükleazları, biri DNA'nın tanınması ve modifikasyonundan, diğeri ise sekans bölünmesinden sorumlu olmak üzere yalnızca iki alt birimden oluşur.

Bu enzimler, işlevleri için iki kofaktör gerektirir: ATP ve magnezyum. Bu tür kısıtlama enzimleri iki asimetrik tanıma bölgesine sahiptir, DNA'yı ATP'ye bağımlı bir şekilde yer değiştirir ve tanıma alanına bitişik olarak 20-30 bp arasında keser.

Tip IV kısıtlama enzimleri

Tip IV enzimleri, DNA'yı metilasyon işaretleri ile kestikleri için tanımlamaları kolaydır, DNA dizisini tanımak ve kesmekten sorumlu birkaç farklı alt birimden oluşurlar. Bu enzimler, kofaktör olarak GTP ve iki değerlikli magnezyum kullanır.

Spesifik yarılma bölgeleri arasında, nükleik asitlerin bir veya her iki ipliği üzerinde metillenmiş veya hidroksimetillenmiş sitozin tortuları olan nükleotid iplikler yer alır.

Tip V kısıtlama enzimleri

Bu sınıflandırma, istilacı organizmalardan spesifik DNA dizilerini tanımlayan ve kesen CRISPER-Cas tipi enzimleri gruplandırır. Cas enzimleri, istilacı organizmaları tanımak ve onlara saldırmak için bir CRISPER sentezlenmiş kılavuz RNA dizisi kullanır.

Tip V olarak sınıflandırılan enzimler, tip I, II ve II enzimler tarafından yapılandırılmış polipeptitlerdir. Hemen hemen her organizmanın DNA bölümlerini geniş bir uzunluk aralığında kesebilirler. Esneklikleri ve kullanım kolaylığı, bu enzimleri, tip II enzimlerle birlikte günümüzde genetik mühendisliğinde en yaygın kullanılan araçlardan biri haline getirmektedir.

Örnekler

Restriksiyon enzimleri, DNA polimorfizmlerinin tespiti için, özellikle popülasyon genetik çalışmalarında ve mitokondriyal DNA kullanılarak yapılan evrimsel çalışmalarda, nükleotid ikame oranları hakkında bilgi elde etmek için kullanılmıştır.

Şu anda, çeşitli amaçlar için bakterilerin dönüştürülmesi için kullanılan vektörler, birden çok kısıtlama enzimi için tanıma mevkilerinin bulunduğu çok klonlama mevkilerine sahiptir.

Bu enzimler arasında en popüler olanları, ilk kez E. coli'den elde edilen ve açıklanan EcoRI, II, III, IV ve V; H. influenzae'den HindIII ve B. amyloliquefaciens'ten BamHI.

Referanslar

1. Bickle, TA ve Kruger, DH (1993). DNA Kısıtlamasının Biyolojisi. Mikrobiyolojik İncelemeler, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA ve Horvath, P. (2007). CRISPR Prokaryotlardaki virüslere karşı kazanılmış direnç sağlar. Science, 315 (Mart), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). Moleküler perspektif: Restriksiyon Endonükleazlar. Kök Hücreler Kanser Tıbbının Temelleri, 20, 190–191.
4. Halford, SE (2001). Kısıtlama enzimleri ile zıplama, atlama ve döngü. Biochemical Society İşlemleri, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Tür kimliğinin korunması ve bakteri türlerinin kontrol edilmesi: kısıtlama / modifikasyon sistemleri için yeni bir işlev mi? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E. ve Kilpatrick, S. (2018). Lewin's Genes XII (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… She, Q. (2015). Genom düzenleme için Tip I ve Tip III CRISPR-Cas sistemlerinden yararlanma. Nükleik Asitler Araştırması, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA ve Wilson, GG (2013). Tip I restriksiyon enzimleri ve akrabaları. Nükleik Asitler Araştırması, 1–25.
9. Nathans, D. ve Smith, HO (1975). DNA moleküllerinin analizi ve yeniden yapılandırılmasında kısıtlama Endonükleazlar. Annu. Rev. Biochem. , 273–293.
10. Nei, M. ve Tajima, F. (1981). Kısıtlama endonükleazları tarafından saptanabilen DNA polimorfizmi. Genetik, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ve Wende, W. (2005). Hücresel ve Moleküler Yaşam Bilimleri Tip II kısıtlama endonükleazları: yapı ve mekanizma. CMLS Hücresel ve Moleküler Yaşam Bilimleri, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Kısıtlama enzimlerinin moleküler biyolojinin temel atı haline gelmesi. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ ve Murray, K. (1976). Kısıtlama endonükleazları. Biyokimyada Eleştirel İncelemeler, (Kasım), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Hedef endonükleaz yapısı ve işlevi. Üç Aylık Biyofizik İncelemeleri, 1–47.
15. Tock, MR ve Dryden, DTF (2005). Kısıtlama ve kısıtlama önleme biyolojisi. Mikrobiyolojide Güncel Görüş, 8, 466–472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16. Wilson, GG ve Murray, NE (1991). Kısıtlama ve Değiştirme Sistemleri. Annu. Rev. Genet. , 25, 585-627.
17. Wu, Z. ve Mou, K. (2016). Campylobacter jejuni virülansı ve popülasyon genetiğine ilişkin genomik içgörüler. Infec. Dis. Çeviri. Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Çok Fonksiyonlu Kısıtlama Endonükleazlarının Yapısı ve Mekanizması. Annu. Rev. Biochem. , 50, 285-315.