BAKTERIYEL YAYMA: ÖZELLIKLER VE HAZIRLIK - BIYOLOJI - 2025

Bakteriyel yayma ince bir filmdir yayma bir ışık mikroskobu altında gözlem için, saydam bir cam levha ya da sürgü yapılır bakteriyel bir mikroorganizma süspansiyonu.

Film şeklindeki uzatma, mikroorganizmaları olabildiğince ayırmak için yapılır, çünkü gruplandırılırlarsa gözlem net değildir.

Şekil 1. Taramalı elektron mikroskobu altında görülen bakteri yayması. Kaynak: pixbay.com

Bakteri kültürleri çalışmasında, onları daha iyi analiz etmek için smear hazırlama, fiksasyon ve boyama teknikleri kullanılır. Mikroorganizmaların küçük boyutlarından dolayı, gözlemleri için mutlaka optik bir mikroskop kullanılması gerekir.

Optik mikroskoplar, lekeleri gözlemlemek için gerekli araçlardır. Bunlar, numunelerin yüksek büyütmeyle görüntülenmesine izin veren optik lensler ve ışık kullanır.

Genelde canlı hücreler çoğunlukla renkli yapılara sahip olmayıp, ışık mikroskobu ile görülürler, renksiz, saydam örneklerdir, çok az iç kontrast ve çevreleriyle gösterirler.

Yardımcı boyama teknikleri kullanılmadan basit parlak alan optik mikroskobu ile gözlem çok sınırlıdır ve mikroorganizmaların hareketinin gözlemlenmesi gibi sadece bazı durumlarda kullanılır.

Mikroorganizmaların optimal gözlemi için kontrast ve çözünürlük arasında bir denge kurulmalıdır. Hücre detayları yüksek çözünürlükte bile mikroskop altında görülemez; Gözlem için kontrast sağlayan boyama teknikleriyle boyaların kullanılması gerekir.

Kaliteli bir bakteri yaymasının özellikleri

Mükemmel kontrast

Mükemmel kontrast elde etmek için faz kontrast mikroskopları, diferansiyel girişim mikroskopları ve karanlık alan mikroskopları olarak adlandırılan sofistike mikroskoplar vardır. Bu mikroskop türü, diğerleri arasında kılıflar ve filamentler gibi bakteri yapılarını gözlemlemek için kullanılır.

Boyama, parlak alan mikroskobu ile elde edilen kontrastı artırmak için basit bir tekniktir. Bu teknikte, mikroskobik gözlemi önemli ölçüde iyileştiren farklı lekeler kullanılabilir.

Lekeler, doğrudan slaytlar üzerindeki mikroorganizma süspansiyonlarının yaymaları veya uzantıları üzerinde, önceden kurutulmuş ve sabitlenmiş olarak gerçekleştirilir.

İyi düzeltme

Fiksasyon, hücre yapılarını korumak için kullanılan bir tekniktir; mikroorganizmaların inaktivasyonuna ve lamın camına yapışmasına neden olur. Farklı sabitleme işlemleri vardır: ısıyla sabitleme ve kimyasal sabitleme.

Isı sabitleme

Bu, bakteriyel bulaşmaları gözlemlemek için en yaygın kullanılan yöntemdir. Teknik, yaymanın bakteriyel süspansiyonunu bir çakmağın alevinden geçirmekten ibarettir. Bu teknik, bakterilerin dış morfolojisini koruyabilir, ancak iç yapılarını yok eder.

Kimyasal fiksasyon

Kimyasal fiksasyon, diğerleri arasında formaldehit veya formaldehit, etanol ve asetik asit gibi koruyucu kimyasalları kullanır. Kimyasal sabitleme maddeleri kullanmanın avantajı, mikroorganizmaların iç hücresel yapılarının korunmasının sağlanmasıdır.

Şekil 2. Kan yayması. Kaynak: Bobjgalindo, Wikimedia Commons'tan

İyi boyama

Önceden kurutulmuş ve sabitlenmiş bir smearı boyamak için en yaygın prosedürler, pozitif veya basit boyama, farklı boyama ve negatif boyamadır. Belirli hücre yapılarının (kapsül, spor, flagella) boyanması için özel teknikler de vardır.

Pozitif boyama veya basit boyama

Pozitif veya basit boyama, en yaygın kullanılan smear boyama tekniğidir. Belirli mikrobiyal yapılara bağlanma kabiliyetine sahip boyalar kullanır ve mikroskop altında gözlemlenmelerini sağlar.

Bu boyaların kimyasal yapılarında, dönüşümlü çift bağlar ve tek bağlar (konjugasyon) ile kromofor grupları (renkli kısım) bulunur. Bu bağlar sırayla bazı hücresel yapılarla iyonik veya kovalent bağlar kurabilir.

Pozitif veya basit boyamada kullanılan boyalar çoğunlukla anilinin kimyasal türevleridir (renkli organik tuzlar).

Öte yandan, boyalar arasında bazik pH'lı bazılarını ve asidik pH'lıları bulabiliriz.

Temel renklendiriciler

Bazik boyalarda, kromofor grubu pozitif bir elektrik yüküne sahiptir. Prokaryotik mikroorganizmaların büyük çoğunluğu nötr bir iç pH'a sahiptir ve hücre yüzeyleri negatif yüklüdür. Bu elektrostatik etkileşim sayesinde, kromofor hücreye bağlanır ve onu boyar.

Bazik boyaların örnekleri, diğerleri arasında metilen mavisi, kristal mor, malakit yeşili, bazik fuscin, safranindir.

Asit boyalar

Asit boyalarda, kromofor grubu negatif elektrik yüküne sahiptir. Bunlar, pozitif yüklü amino gruplarıyla proteinleri boyamak için kullanılır. Asit boyaların örnekleri, asit fuscin, rose Bengal, Kongo kırmızısı ve eozindir.

Diferansiyel boyama

Diferansiyel boyama tekniği, mikroskop altında farklı mikroorganizmaları ayırt etmek için farklı renk veya yoğunlukta iki boyanın uygulanmasından oluşur. Gram boyası ve asit-alkol direnci boyası, bakteriyolojide en sık kullanılan diferansiyel boyalardır.

Gram boyası, hücre duvarı tipinin yanı sıra şeklini, boyutunu, hücre gruplamasını bilmek için bir ön test olarak kullanılır. Gram boyama testi kullanılarak hücre duvarı bakterileri, Gram pozitif bakteriler ve Gram negatif bakteriler olarak sınıflandırılır.

Negatif boyama

Bu teknikte hücrenin içine nüfuz etmeyen ancak mikroorganizmaların bulunduğu ortamı siyah arka plan olarak gösteren kimyasal boyalar kullanılır.

Negatif boyama tekniğinde, smear, oda sıcaklığında kurumaya bırakıldıktan sonra ışığın geçişine opak bir film oluşturan bir damla çini mürekkebi veya nigrosin süspansiyonu ile yapılır. Böylelikle mikroorganizmalar karanlık bir arka plan üzerinde parlak şekiller olarak görünür.

Hazırlık

A. Smear

1. Slaytları iyice yıkayın, emici kağıtla kurulayın ve etiketleyin. Etiket, müstahzarın içeriğini, tarihi ve onu işleyen kişinin adını belirtmelidir.

2.- Çakmağı yakın ve parlak kırmızı olana kadar alevdeki aşılama döngüsünü sterilize edin.

3. - Tutamağı soğumaya bırakın.

4.- Bakteri kültürü tüpünü alın, kapağı çıkarın ve tüpün ağzını brülör alevinin (alev) yanından hızla geçirin.

5. - İnokülasyon özesini bakteri kültürünü içeren tüpe yerleştirin ve örneği alın.

6.- Kültür sıvı ortamda ise, sap ile alınan numuneyi slaydın ortasına yerleştirin ve yaklaşık 2 cm çapında bir daire şeklinde dikkatlice yayın.

7. - İnokülasyon halkasını tekrar sterilize edin.

8. - Lekenin havada kurumasına izin verin.

9. - 3 ile 8 arasındaki adımları üç kez tekrarlayın.

10.- Kültür katı ortamdaysa, slayta önceden bir damla damıtılmış su konulmalıdır. Bu, 2 ila 5. adımlarda (aseptik koşullar) belirtildiği gibi, alınan kültürün küçük bir örneğini inokülasyon döngüsüyle karıştırmak için yapılır.

11.- Seyreltilmiş numuneyi lamın üzerine su damlasıyla yayın ve üç kez tekrarlayın.

B. Fiksasyon

1. - Sıvı ortamdaki kültürlerden kuru sürüntülere iki damla metanol veya mutlak etanol ekleyin.

2.- Çakmaktan uzakta havayla kurumaya bırakın.

3.- Yayma katı ortamdaki bir kültürden geliyorsa, kuru yayma ısı ile sabitlenir, hafif alevin en sıcak kısmından 2 ila 3 kez hızlı bir şekilde geçirilir.

4. - Sol elin sırt kısmı ile smearın alt kısmına dokunun (sağ elini kullananlar için; aksi takdirde sağ eli kullanın) ve soğuk olduğunu doğrulayın.

C. Basit boyama

1. - Seçilen lekeden 2 damla smear'a ekleyin ve her leke için özel protokollerde gereken süre boyunca etki etmesi için bırakın (genellikle 1 ile 5 dakika arasında).

2.- Bazı lekelerin aktivasyonu için ısı kullanılması gerekir, bu durumda slaydı daha hafif alevde ısıtırken çok dikkatli olmak gerekir (cımbızla hareket ettirin ve kaynatmaktan kaçının). Yaymanın aşırı ısınması, gözlemlenecek hücreleri tahrip edebilir.

3.- Fazla renklendiriciyi bir piketten distile su ile yıkayarak uzaklaştırın. Yıkama suyunu, slaytı çalışma masasına eğik olarak kenarına hafifçe vurarak çıkarın.

4. Hava kurumasına izin verin.

5.- Gözlem türüne bağlı olarak bu aşamada lamel kullanılır veya kullanılmaz. Lamel, lekeyi korur ve korur. Bu aşamada bir yağ daldırma gözlemi yapılırsa, lamel kullanılmaz ancak leke korunamaz.

D.Smearın kesin korunması

1.- Smearı en az 5 dakika boyunca aşağıda belirtilen solüsyonların her birine arka arkaya daldırın. Bu "banyoların" amacı, sürüntüyü tamamen kurutmaktır. Smear bir sonraki banyoya uygulanmadan önce her reaktif tamamen boşaltılmalıdır.

Susuzlaştırma banyolarının sırası aşağıdaki gibidir:

1. Etanol% 70
2. Etanol% 95
3. Saf aseton
4. Aseton -ksilol 1: 1 karışımı
5. xylol

Ardından kurumaya bırakın.

2.- Tercihen 22 × 22 mm olan lamelleri Kanada balzamı veya başka bir montaj ortamı kullanarak monte edin.

Referanslar

1. Briggs, G. (1965). Mikrobiyolojik Laboratuvar Kazaları ve Enfeksiyonlarında Nedensel Faktörler. ABD Ordusu Biyolojik Laboratuvarları. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG ve Welch, CT (2017). Mikrobiyoloji: Bir Laboratuvar El Kitabı. Pearson.
3. Holt, JG Editörü. (1977). Daha kısa Bergey'in Belirleyici Bakteriyoloji El Kitabı. 8 ^inci Baltimore: Williams ve Wilkins A.Ş.
4. Johnson, TR ve Case; CL (2018). Mikrobiyolojide Laboratuvar Deneyleri. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Teşhis Mikrobiyolojisi. 14 ^inci St Louis, ABD: Elsiever, Inc.