GIEMSA LEKESI: MANTIK, MALZEME, TEKNIK VE KULLANIMLAR - BIYOLOJI - 2025

Giemsa lekesi asit ve temel boyaların karışımına dayalı, klinik numuneler boyama türüdür. Yaratılışı, Almanya'dan bir kimyager ve bakteriyolog olan Gustav Giemsa'nın bileşikleri stabilize etmek için gliserol ekleyerek mükemmelleştirdiği Romanowsky tarafından yapılan çalışmadan ilham aldı.

Orijinal Romanowsky tekniğinde üretilen değişiklikler, mikroskobik gözlemleri önemli ölçüde iyileştirmeye izin verdi, bu nedenle teknik Giemsa boyası adıyla vaftiz edildi.

Giemsa boyası ile boyanan çeşitli örnekler. A. Periferik kanda Trypanosoma evansi. B. Normal kan hücreleri. C. Periferik kanda Borrelia theileri. D. Burkitt lenfoma.

Uygulanması basit, oldukça fonksiyonel ve ekonomik bir teknik olduğu için şu anda klinik laboratuvarda hematolojik yaymalar, kemik iliği örnekleri ve doku bölümleri için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Giemsa boyama tekniği, spesifik hücre yapılarının gözlemlenmesine izin verdiği için sitolojik çalışmalar için çok faydalıdır. Bu teknik, sitoplazmaları, çekirdekleri, nükleolleri, vakuolleri ve hücre granüllerini boyayarak ince kromatin izlerini bile ayırt edebilir.

Ayrıca, çekirdek-sitoplazma ilişkisinin kaybını görselleştirmek mümkün olduğunda, çekirdeğin boyutunda, şeklinde veya renginde önemli değişiklikler tespit edilebilir.

Öte yandan kemik iliğinde ve periferik kandaki olgunlaşmamış hücrelerin tanımlanmasına olanak sağlar ve lösemi gibi ciddi hastalıkların teşhisi için önemlidir. Diğerlerinin yanı sıra hemoparazitleri, ekstra ve hücre içi bakterileri, mantarları tespit etmek de mümkündür.

Sitogenetikte, hücrelerin mitozunu incelemek mümkün olduğu için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Giemsa boyamasının temeli

Romanowsky tipi boyalar, sırasıyla bazik ve asit yapılarının boyanmasını sağlamak için asidik ve bazik boyalar arasında bir kontrast kullanımına dayanır. Görülebileceği gibi, asit boyaların bazik yapıları lekelemek için bir afinitesi vardır ve bunun tersi de geçerlidir.

Kullanılan temel boya, metilen mavisi ve oksitlenmiş türevleridir (Azure A ve Azure B), asit boya ise eozindir.

Hücrelerin asit yapıları, diğerlerinin yanı sıra, bölümlere ayrılmış bazofillerin granülleri olan nükleik asitlerdir, bu nedenle bunlar metilen mavisi ile boyanacaktır.

Bu aynı anlamda, hücrelerin temel yapıları, hemoglobin ve diğerleri arasında bölümlere ayrılmış eozinofillerde bulunanlar gibi bazı granüllerdir; bunlar eozin ile boyanacaktır.

Öte yandan metilen mavisi ve gök mavisi metakromatik renklendiriciler olarak karakterize edildiğinden, farklı yapılara sahip oldukları polianyonların yüküne göre değişken bir renk tonu sağlayabilirler.

Bu, bazik ve asit boyaların stratejik kombinasyonu, her yapının biyokimyasal özelliklerine göre, asit yapılarda soluk mavi, lacivert, leylak ve mor tonlar arasında yürüyen geniş bir renk yelpazesi geliştirmeyi başarır.

Eozin tarafından sağlanan renklendirme daha kararlı iken kırmızımsı-turuncu ve somon arasında renkler oluşturur.

malzemeler

Stok çözümünü hazırlamak için malzemeler

Stok çözeltinin hazırlanması, 600 mg toz Giemsa boyası, 500 cc aseton içermeyen metil alkol ve 50 cc nötr gliserin ölçülmesini gerektirir.

Stok çözümü nasıl hazırlanır

Ağır Giemsa tozunu bir havana yerleştirin. Topaklar varsa püskürtülmelidir. Ardından kayda değer miktarda ölçülen gliserin ekleyin ve çok iyi karıştırın. Elde edilen karışım çok temiz bir kehribar şişeye boşaltılır.

Gliserinin geri kalanı havana yerleştirilir. Harcın duvarlarına yapışmış olan renklendiricinin geri kalanını temizlemek için tekrar karıştırın ve aynı kavanoza dökün.

Şişe kapatılır ve 2 saat 55ºC'de su banyosuna yerleştirilir. Su banyosundayken karışımı her yarım saatte bir hafifçe sallayın.

Ardından, alkolün yerleştirilmesi için karışımın soğumasına izin verilir. Önceden, ölçülen alkolün bir kısmı kalan renklendiricinin yıkanmasını bitirmek için harca yerleştirilir ve ardından alkolün geri kalanıyla birlikte karışıma eklenir.

Bu hazırlık en az 2 hafta olgunlaşmaya bırakılmalıdır. Stok solüsyonunun kullanılan kısmı filtrelenmelidir.

Preparatın kirlenmesini önlemek için, sürekli kullanımda olacak kısmın damlalıklı küçük kehribar bir şişeye aktarılması önerilir. Reaktif her bittiğinde tekrar doldurun.

Buffer çözümünü hazırlamak için malzemeler

Öte yandan, pH 7.2'de bir tampon çözelti aşağıdaki gibi hazırlanır:

(Susuz) sodyum fosfat (NaHPO 6.77 g ₄ ), potasyum dihidrojen fosfat (KH 2,59 g ₂ PO ₄ ) ve damıtılmış su 1000 cc kadar tartılır.

Renklendiricinin son hazırlığı

Nihai boyama çözeltisinin hazırlanması için, 2 ml filtrelenmiş stok çözeltisi ölçülür ve 6 ml tampon çözeltisi ile karıştırılır. Karışımı karıştır.

Dikkate alınması gereken önemli bir gerçek, renklendirme hazırlama tekniklerinin ticari şirkete bağlı olarak değişebileceğidir.

Renklendirmeyi gerçekleştirmek için gereken ek malzemeler

Tarif edilen malzemeler dışında, boyama köprüleri, yıkama için sulu veya tamponlu tişörtler, nesneler için nesne slaytları veya kapakları, boyama sürelerini kontrol etmek için bir kronometre ve kurutma kağıdı veya kurutmak için kullanılabilecek bazı malzemeler ( gazlı bez veya pamuk).

Teknik

Boyama işlemi

1) Boyamadan önce numunenin smearı temiz bir slayt üzerinde hazır olmalıdır.

Örnekler kan, kemik iliği, histolojik doku kesitleri veya serviko-vajinal örnekler olabilir. Sürmelerin ince olması ve renklendirmeden önce 1-2 saat kuruması tavsiye edilir.

2) Bir boyama köprüsüne, renklendirilmesi gereken tüm kağıtları yerleştirin. Her zaman aynı sırada çalışırsınız ve her sayfa iyi tanımlanır.

3) Sürüntü üzerine birkaç damla% 100 metil alkol (metanol) koyun ve numuneyi sabitlemek ve dehidre etmek için 3 ila 5 dakika etki etmesini bekleyin.

4) Tabakada bulunan metanolü atın ve kurumaya bırakın.

5) Kuruduktan sonra, son boyama solüsyonunu bir damlalıkla tüm tabaka kaplanana kadar yerleştirin. 15 dakika etki etmesini bekleyin. Bazı yazarlar 25 dakikaya kadar önermektedir. İş evine göre değişir.

6) Lekeyi boşaltın ve smear'ı distile su veya 7.2 tampon solüsyonu ile yıkayın.

7) Bir kurutma kağıdı üzerinde, bir destek yardımıyla dikey olarak düzenlenmiş, açık havada tabakaları kurumaya bırakın.

8) Leke izlerini çıkarmak için slaydın arkasını alkollü çubukla veya pamuklu çubukla temizleyin.

Araçlar

Giemsa boyama tekniği, hematoloji, mikoloji, bakteriyoloji, parazitoloji, sitoloji ve sitogenetik dahil olmak üzere çeşitli alanlarda kullanılmaktadır.

Hematoloji

Bu lekeye verilen en sık kullanımdır. Bununla, kemik iliğinde veya periferik kan örneklerinde bulunan hücrelerin her biri tespit edilebilir. Her serinin sayısını tahmin etmenin yanı sıra, lökositoz veya lökopeni, trombositopeni vb. Tespit edebilme.

Olgunlaşmamış hücrelerin tanımlanmasında hassas olduğu için akut veya kronik lösemilerin teşhisinde önemlidir. Diğerlerinin yanı sıra orak hücre anemisi, orak hücre gibi anemi teşhisini yapmak da mümkündür.

Mikoloji

Bu alanda, doku örneklerinde Histoplasma capsulatum (hücre içi dimorfik mantar) aramak için kullanımı yaygındır.

Bakteriyoloji

Giemsa ile boyanan hematolojik yaymalarda, tekrarlayan ateş denilen hastalığı olan hastalarda Borrelias sp tespit edilebilmektedir. Spiroketler, ateşin zirvesinde alınan örneklerde eritrositler arasında bol miktarda bulunur.

Rickettsia sp ve Chlamydia trachomatis gibi hücre içi bakterileri enfekte olmuş hücrelerde görselleştirmek de mümkündür.

parazitoloji

Parazitoloji alanında Giemsa boyama, sıtma, Chagas hastalığı ve leishmaniasis gibi paraziter hastalıkları teşhis etmeyi mümkün kılmıştır.

İlk ikisinde sırasıyla Plasmodium sp ve Trypanosoma cruzi parazitleri enfekte hastaların periferik kanında görülebilir, hastalığın hangi evrede olduğuna bağlı olarak farklı evrelerde bulunabilirler.

Kandaki parazit arayışını iyileştirmek için Giemsa boyasının May-Grünwald boyası ile karıştırılması önerilir.

Aynı şekilde kutanöz leishmaniasis, parazitin bulunduğu Giemsa lekeli deri biyopsi örnekleri değerlendirilerek teşhis edilebilir.

sitoloji

Giemsa boyama, endoservikal numunelerin sitolojik çalışması için de kullanılır, ancak bu amaç için en sık kullanılan teknik değildir.

Ancak kaynakların yetersiz olduğu durumlarda, Papanicolaou tekniğinin sunduğu işlevselliğe benzer bir işlevselliğe sahip olarak ve daha düşük bir maliyetle kullanılabilir. Ancak, denetçinin uzmanlığı gerektirir.

Sitogenetik

Giemsa boyamasının ilgili bir özelliği, DNA'nın adenin ve timinden zengin bölgelerine güçlü bir şekilde bağlanma kabiliyetidir. Bu, DNA'nın hücre mitozu sırasında, farklı yoğunlaşma durumlarında görselleştirilmesine izin verir.

Bu çalışmalar, kromozomların farklı bölgelerinin kopyaları, silinmeleri veya yer değiştirmeleri gibi renk sapmalarını tespit etmek için gereklidir.

Giemsa boyasının etkinliğini gösteren araştırma

Cannova ve arkadaşları (2016), kutanöz leishmaniasis tanısı için 3 boyama tekniğini karşılaştırdı.

Bunun için deneysel bir hayvandan (Mesocrisetus auratus) elde edilen örnekleri deneysel olarak Leishmanias ile aşıladılar.

Yazarlar, Giemsa boyasının Pap-mart® ve Gaffney boyasından daha iyi olduğunu gösterdiler. Bu nedenle, Giemsa boyasının kutanöz leishmaniasis teşhisi için ideal olduğunu düşündüler.

Yazarlar tarafından elde edilen mükemmel sonuçlar, Giemsa karışımını oluşturan boyaların kombinasyonunun, amastigotların yapılarının hem hücre içi hem de hücre dışı olarak net bir şekilde ayırt edilmesini sağlayan, uygun bir kontrast oluşturmak için gerekli koşulları sunması gerçeğinden kaynaklanmaktadır.

Diğer teknikler de (Pap-mart® ve Gaffney) bunu yaptı, ancak daha zayıf bir şekilde ve dolayısıyla görselleştirmek daha zor. Leishmaniasis'in parazitolojik tanısı için Giemsa boyasının önerilmesinin nedeni budur.

Benzer şekilde Ramírez ve arkadaşları (1994) tarafından yapılan bir çalışmada, konjonktival smearlarda Giemsa ve Lendrum boyalarının Chlamydia trachomatis'in tanımlanması için geçerliliği değerlendirildi.

Yazarlar Giemsa ve Ledrum boyalarının eşit özgüllüğe sahip olduğunu belirlediler, ancak Giemsa'nın daha duyarlı olduğu bulundu.

Bu, Giemsa boyasının neden şu anda klamidya enfeksiyonlarının teşhisinde, özellikle de az kaynak varsa, en sık kullanılan olduğunu açıklıyor.

Kaynak: PanReac Applichem ITW Reagents. Giemsa lekesi. Sürüm 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, İspanya.

İyi boyama için öneriler

Yaprakların kuruması hızlandırılmamalıdır. Açık havada kuruması için makul bir süre beklenmelidir. Yaklaşık 2 saat.

En iyi sonuçlar için 2 saat sonra hemen boyayın.

Smearlerin daha iyi sabitlenmesi ve boyanması için numunenin ince ve homojen bir tabaka kalacak şekilde slayt üzerine dağıtılması gerekir.

Tercih edilen kan numunesi kılcaldır, çünkü yayma doğrudan kan damlasından yapılır ve bu nedenle numune, hücresel yapıların korunmasına yardımcı olan herhangi bir katkı maddesi içermez.

Bununla birlikte, venöz kan kullanılıyorsa, heparin genellikle hücreleri deforme ettiğinden, EDTA bir antikoagülan olarak kullanılmalı ve heparin kullanılmamalıdır.

Giemsa boyamasında yaygın hatalar

Bu renklendirme uygulamasında hatalar yapılabilir. Yapıların tonalitelerindeki ani değişikliklerle kanıtlanırlar.

Son derece mavi renk

Şunlardan dolayı olabilir:

• Çok kalın lekeler
• Boyama süresinin aşılması
• Yetersiz yıkayın.
• Nötr (alkali) pH'ın çok üzerinde reaktif kullanımı.

Bu koşullar altında aşağıdaki yapıların renkleri bozulur, somon pembesi yerine eritrositler yeşil görünecek, tuğla kırmızısı boyanması gereken eozinofillerin granülleri mavimsi veya gri olacak ve böyle devam edecektir. normal tonlarda sapma.

Aşırı pembe renk

Şunlardan dolayı olabilir:

• Yetersiz boyama süresi.
• Uzun süreli veya aşırı yıkama.
• Kötü kurutma.
• Yüksek asidik reaktiflerin kullanımı.

Bu özel durumda, normalde maviye boyayan yapılar neredeyse görünmezken, pembeyle boyanan yapılar büyük ölçüde abartılı tonlara sahip olacaktır.

Örnek: Kırmızı kan hücreleri parlak kırmızı veya parlak turuncuya dönecek, nükleer kromatin soluk pembe görünecek ve eozinofil granülleri koyu parlak kırmızıya boyanacaktır.

Smearda çökeltilerin varlığı

Sebepler şunlar olabilir:

• Kirli veya kötü yıkanmış filmler kullanın.
• Smearın iyice kurumasına izin vermeyin.
• Sabitleme solüsyonunu çok uzun süre bırakmak.
• Boyama sonunda yetersiz yıkama.
• Yetersiz filtreleme veya kullanılan renklendiricinin filtrasyonu yok.

Morfolojik eserlerin varlığı

Morfolojik eserler simirlerde görünebilir ve mevcut yapıları görselleştirmeyi ve yorumlamayı zorlaştırır. Bunun nedeni:

• Heparin gibi kullanılan antikoagülan türü.
• Kirli, bozulmuş veya yağlı filmlerin kullanılması.

Depolama modu

Hazırlandıktan sonra, boyanın çökelmesini önlemek için boya oda sıcaklığında (15 - 25 ° C) tutulmalıdır. Sıkıca kapatılmış kehribar bir kapta saklanmalıdır.

Referanslar

1. Cannova D, Brito E ve Simons M. Kutanöz Leishmaniasis tanısı için boyama tekniklerinin değerlendirilmesi. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. PanReac Applichem ITW Reaktifleri. Giemsa lekesi. Sürüm 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, İspanya.
3. Clark G. Boyama prosedürleri (1981), 4. baskı. Williams ve Willkins.
4. Uygulamalı Klinik Kimya. In vitro diagnostik için Giemsa boyası. Distribütör: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F ve Grazioso C. Chlamydia trachomatis'in tanımlanması için konjonktival smearlarda Giemsa ve Lendrum boyalarının geçerliliği. Bol Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Genel Mikoloji. 1994. 2. Baskı, Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Karakas.
7. "Giemsa lekesi." Vikipedi, bedava ansiklopedi. 1 Eyl 2017, 01:02 UTC. 6 Aralık 2018, es.wikipedia.org.