REKOMBINANT DNA: TEKNIK, UYGULAMALAR VE TEMELLER - BIYOLOJI - 2025

Rekombinant DNA (rDNA veya rDNA) kuruluşların iki segment entegre ederek, laboratuarda oluşturulmuş yapay nükleik asit molekülüdür. Hibrit özelliği sayesinde kimerik DNA olarak da bilinir. Bu tür DNA doğada bulunmaz.

Bunu üretmenin temel metodolojisi şunları içerir: (a) bir hedef DNA'nın seçimi ve bunun başka bir DNA fragmanına (genellikle bir bakteriyel plazmid) eklenmesi; (b) bu ​​plazmidin bir bakteriye katılması, (c) bakterilerin antibiyotikler vasıtasıyla seçilmesi ve son olarak (d) genin ekspresyonu.

Kaynak: Pixabay.com

Teknik, araştırmacının kararına göre belirli DNA parçalarını kopyalayıp yapıştırmayı mümkün kılan bir dizi enzimden yararlanır.

Rekombinant teknolojinin amacı, çoğu durumda, moleküler biyolog tarafından gelecekteki araştırmalar için istenen bir proteinin (rekombinant protein olarak bilinir) ekspresyonu veya insan insülini gibi ticari ve terapötik değeri olan bir protein yaratmaktır. Örneğin.

Rekombinant DNA tekniğinin temelleri ve genetik mühendisliğinde kullanımı

Moleküler biyolojinin temel dogması

Bildiğimiz tüm organik varlıklar birkaç özelliği paylaşır. Bunlardan biri genetik materyalin doğası ve proteinlerin üretilme şeklidir - moleküler biyolojinin merkezi “dogması” olarak bilinen bir süreç.

Birkaç virüs haricinde, tüm organizmalar genetik bilgiyi DNA'da (deoksiribonükleik asit) depolar ve hücre çekirdeğinde çok kompakt ve düzenli bir şekilde toplanır.

Gen ekspresyonu için DNA molekülü, haberci RNA'ya kopyalanır ve ikincisi, proteinlerin yapı taşları olan amino asitlerin diline çevrilir.

Rekombinant DNA nedir?

1970'ler ve 1980'ler arasında moleküler biyologlar, hücre içinde doğal olarak meydana gelen süreçlerden yararlanmaya başladılar ve bunları laboratuvara yansıtmayı başardılar.

Bu şekilde, hayvan kökenli bir gen (örneğin bir omurgalı) bir bakteriden bir DNA segmenti içine sokulabilir; veya bir bakterinin DNA'sı bir viral DNA ile birleştirilebilir. Böylece, rekombinant bir DNA'yı iki farklı organizmadan DNA'dan oluşan bir molekül olarak tanımlayabiliriz.

Bu hibrit veya rekombinant molekül yaratıldığında, ilgilenilen gen ifade edilir. Kelime ifadesi ile proteine ​​çeviri sürecine atıfta bulunmak istiyoruz.

Kısıtlama enzimleri ve ligazlar: sürecin anahtarı

Rekombinant DNA teknolojisinin geliştirilmesindeki anahtar unsur, kısıtlama enzimlerinin keşfiydi.

Bunlar, DNA'yı (nükleazları) belirli dizilere ayırma yeteneği gösteren ve "moleküler makas" görevi gören protein molekülleridir. Bu enzimler tarafından üretilen parçalara sınırlama parçaları denir.

Bahsedilen enzimler, hedef sekansta (her iki zincirde aynı yükseklikte) simetrik kesikler veya asimetrik kesikler oluşturabilir. Kısıtlama enzimlerinin etkisinin önemli bir yönü, zincirlerin bölünmesinden sonra, aynı enzim tarafından kesilen diğer kenarı tamamlayan bir "gevşek kenar" elde edilmesidir.

Bazı örnekler ECOR 1 ve Sma 1'dir. Şu anda 200'den fazla kısıtlama enzimi türü bilinmektedir ve ticari olarak temin edilebilir.

Yararlı olması için bir makasın yapıştırıcı ile birlikte olması gerekir. DNA'nın (önceden kısıtlama enzimleriyle işlemden geçirilmiş) bu sızdırmazlık etkisi ligazlar tarafından gerçekleştirilir.

Teknik: Bir organizmanın DNA'sı laboratuvarda yapay olarak nasıl değiştirilir?

Aşağıda, rekombinant DNA teknolojisinin gerektirdiği ana adımları açıklayacağız. Hepsi bir moleküler biyoloji laboratuvarında profesyoneller tarafından yürütülmektedir.

"Klon" nedir?

Deneysel protokole devam etmeden önce, moleküler biyoloji ve biyoteknolojide "klon" terimi ve "klon" fiilinin yaygın olarak kullanıldığına dikkat etmeliyiz. Bu kafa karışıklığına yol açabilir.

Bu bağlamda, bütün bir organizmanın klonlanmasından (örneğin, ünlü koyun Dolly'nin durumunda olduğu gibi) değil, bir gen olabilecek bir DNA parçasının klonlanmasından bahsediyoruz. Yani, dizinin birçok kopyasını - genetik olarak özdeş - üretmek.

1. DNA izolasyonu ve elde edilmesi

İlk adım, hangi sırayı kullanmak istediğinize karar vermektir. Bu tamamen araştırmacıya ve çalışmasının amaçlarına bağlıdır. Bu DNA daha sonra izole edilmeli ve saflaştırılmalıdır. Bunu başarmak için gereken yöntemler ve prosedürler sırasıyla vücuda ve dokuya bağlıdır.

Genel olarak, dokunun bir kısmı alınır ve proteinaz K (bir proteolitik enzim) ile bir liziz tamponunda işleme tabi tutulur ve daha sonra DNA ekstrakte edilir. Daha sonra, genetik materyal küçük parçalara bölünür.

2. Klonlama vektörü

Hazırlık aşamalarından sonra araştırmacı, ilgilenilen DNA segmentini bir klonlama vektörüne sokmaya çalışır. Şu andan itibaren bu DNA parçasına beyaz DNA adını vereceğiz.

Plazmidler

Bakteriyel kökenli bir plazmidde en çok kullanılan vektörlerden biri. Plazmid, bakterilerde doğal olarak bulunan çift sarmallı, dairesel bir DNA molekülüdür. Bakteri kromozomuna yabancıdırlar - yani ekstrakromozomaldirler ve bu prokaryotlarda doğal olarak bulunurlar.

Bir vektörün temel öğeleri şunlardır: (a) DNA sentezine izin veren bir replikasyon kaynağı; (b) bazı antibiyotiklere direnç gibi, hedef DNA ile plazmidi taşıyan organizmaları tanımlamayı mümkün kılan seçim ajanı; ve (c) kısıtlama enzimleri tarafından tanınacak dizilerin bulunduğu çoklu klonlama sitesi.

Laboratuvardaki ilk başarılı rekombinant DNA, E. coli bakterisinden plazmit pSC101'e klonlandı. Bu, replikasyonun kaynağına ek olarak, kısıtlama enzimi EcoRI için bir sınırlama bölgesi ve bir antibiyotiğe direnç için bir gen içerir.

Hedef DNA'nın plazmit içerisine sokulması, önceki bölümde açıklanan kısıtlama enzimlerinin ve ligazların moleküler araçları kullanılarak gerçekleştirilir.

Kalan vektör türleri

Plazmidlere ek olarak DNA, bakteriyofaj lambda, kozmidler, YAC'ler (maya yapay kromozomları), BAC'ler (bakteriyel yapay kromozomlar) ve fajmidler gibi diğer vektöre eklenebilir.

3. Rekombinant DNA'nın tanıtımı

Rekombinant DNA molekülü (plazmid veya diğer vektörde ilgilenilen gen) elde edildikten sonra, bir bakteri olabilen bir konakçı veya konakçı organizmaya dahil edilir.

Yabancı DNA'yı bir bakteriye sokmak için, bakteriyel dönüşüm adı verilen bir teknik kullanılır; burada organizma, DNA almaya yatkın hale getiren iki değerlikli katyonlarla bir işleme tabi tutulur.

Metodolojik olarak, kültürümüzdeki bakterilerin% 100'ünün rekombinant DNA molekülümüzü etkili bir şekilde aldığını garanti edemeyiz. Plazmitin antibiyotik direnci içeren kısmının devreye girdiği yer burasıdır.

Böylece plazmidi alan bakteriler belirli bir antibiyotiğe dirençli olacaktır. Bunları seçmek için söz konusu antibiyotiği uygulamak ve hayatta kalanları almak yeterli olacaktır.

4. Proteini "hasat edin"

Rekombinant DNA'mızla bakterileri seçtikten sonra, ilgilenilen protein ürününü oluşturmak için konağın enzimatik mekanizmasını kullanmaya devam ediyoruz. Bakteriler çoğaldıkça, plazmid yavrularına aktarılır, böylece bölünme sırasında kaybolmaz.

Bu prosedür, bakterileri bir tür protein "fabrikası" olarak kullanır. Daha sonra, etkili tıbbi tedavilerin geliştirilmesinde çok önemli bir prosedür olduğunu göreceğiz.

Kültür hazır olduğunda ve bakteri büyük miktarlarda protein ürettiğinde, hücre parçalanır veya bozulur. Proteinlerin fizikokimyasal özelliklerine göre saflaştırılmasına izin veren çok çeşitli biyokimyasal teknikler vardır.

Başka bir deneysel bağlamda, proteini üretmekle ilgilenmeyebiliriz, bunun yerine DNA dizisini kendi başına elde etmekle ilgileniyoruz. Durum böyle olsaydı, ilgili deneyleri gerçekleştirmek için yeterli hedef DNA'ya sahip olmak için ilgili parçanın birden çok kopyasını oluşturmak için plazmid kullanılırdı.

Uygulamalar

Rekombinant DNA teknolojisi, moleküler biyoloji, biyoteknoloji, tıp ve diğer ilgili alanlara sonsuz sayıda olasılık açtı. En göze çarpan uygulamaları şunlardır.

Genetik analiz

İlk uygulama doğrudan moleküler biyoloji laboratuvarları ile ilgilidir. Rekombinant DNA teknolojisi, araştırmacıların genlerin normal işlevini anlamalarını sağlar ve üretilen proteinler daha sonraki araştırmalarda kullanılabilir.

İlaç endüstrisi

Rekombinant DNA prosedürü kullanılarak üretilen proteinlerin tıpta uygulamaları vardır. Alanda çok ilgili iki örnek, bu proteinden yoksun hastalarda uygulanan insan insülini ve büyüme hormonudur.

Rekombinant DNA sayesinde, bu proteinler onları başka bir insandan çıkarmaya gerek kalmadan üretilebilir, bu da ek metodolojik komplikasyonları ve sağlık risklerini temsil eder. Bu, sayısız hasta için yaşam kalitesini iyileştirmeye yardımcı oldu.

Referanslar

1. Baca, LEL ve Álvarez, CLC (2015). Biyoloji 2. Grupo Editoryal Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE ve Hausman, RE (2000). Hücre: moleküler bir yaklaşım (Cilt 10). Washington, DC: ASM basını.
3. Devlin, TM (2004). Biyokimya: klinik uygulamaları olan ders kitabı. Tersine döndüm.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M. ve Hou, H. (2016). Hayatı İyileştirmede Rekombinant DNA Teknolojisinin Rolü. Uluslararası genomik dergisi, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP ve Mindan, P. (1996). Patolojik anatomi. Elsevier İspanya.
6. Tortora, GJ, Funke, BR ve Case, CL (2007). Mikrobiyolojiye giriş. Panamerican Medical Ed.
7. MJ (1989). İnsan insülini: DNA teknolojisinin ilk ilacı. Amerikan Sağlık Sistemi Eczacılığı Dergisi, 46 (11_suppl), S9-S11.