GRAM BOYAMA: MANTIK, MALZEME, TEKNIK VE KULLANIMLAR - BIYOLOJI - 2024

Gram boyama basit ve en kullanışlı olan boyama teşhis Mikrobiyolojide tekniği. Bu teknik, 1884 yılında, hücre duvarının bileşimine göre bakterileri Gram pozitif ve Gram negatif olarak sınıflandırmayı başaran Danimarkalı doktor Hans Christian Gram tarafından oluşturuldu.

Teknik, reaktifleri stabilize etmek ve boyamanın kalitesini iyileştirmek için 1921'de Hucker tarafından bazı modifikasyonlara tabi tutuldu, bu nedenle Gram boyası Gram-Hucker olarak da bilinir.

Gram boyası ile boyanan çeşitli smearlar. A. Gram pozitif kok. B. Gram negatif çubuklar. C. Gram pozitif, polimorfonükleer ve mononükleer basiller. D. Mayalar.

Bu teknikle mikroorganizmaların şeklini, yani diğerlerinin yanı sıra kok, basil, kokobasil, pleomorfik, filamentli olmaları halinde de gözlemlemek mümkündür. Uzaydaki dağılımının yanı sıra: bir kümede, bir zincirde, izole edilmiş, çiftler halinde, tetradlarda vb.

Bakteriyel enfeksiyondan şüphelenildiğinde, alınan örneklerin çoğu bir slayta sürülmeli ve mikroskobik inceleme için Gram boyanmalıdır.

Gram raporu, nihai kültür sonucunu elde etmeden önce doktora enfeksiyona neden olabilecek mikroorganizmanın türü konusunda rehberlik edecektir.

Bazı durumlarda hastanın hayatı çok tehlikeye girer, bu nedenle doktorlar mikroorganizmanın tanımlanmasını beklerken ampirik bir tedavi uygulamak için acilen Gram raporuna ihtiyaç duyar.

Örneğin, Gram beyin omurilik sıvısında Gram pozitif koklar olduğunu ortaya koyarsa, doktor, kendisi için oluşturulan protokollere göre bu tür bakterileri ortadan kaldıran antibiyotiklerle ilk tedaviye rehberlik edecektir.

İzole edilen mikroorganizmanın adı ve ilgili antibiyogramı ile nihai sonuç geldiğinde, doktor tedaviyi değiştirip değiştirmeyeceğini değerlendirecektir. Bu karar, mikroorganizmanın aldığı antibiyotiklere duyarlılığı ve hastanın evrimi araştırmasına göre verilecektir.

temel

Bu, 4 temel adımı olan bir tekniktir: boyama, mordan ile fiksasyon, renk değişikliği ve zıt boyama. Bu nedenle bu teknik, bakterileri renklendirmenin yanı sıra farklılaştırılmasına da olanak sağlar.

Kristal menekşe kullanılan ilk renklendiricidir. Peptidoglikana afinitesi vardır ve mor renkte bulunan tüm bakterileri boyar, ardından bir mordan görevi gören lugol yerleştirilir, yani hücre içinde çözünmez kristal menekşe-iyot komplekslerinin - ribonükleer proteinlerin oluşumuna neden olur. .

Kalın bir peptidoglikan duvarına sahip olan Gram pozitif bakteriler, daha fazla kompleksler (kristal mor-iyot) oluştururlar, bu nedenle boyayı tutarlar.

Ek olarak, Gram pozitif bakteri duvarının oksitleyici maddelere (Lugol) büyük afinite gösteren daha fazla miktarda doymamış asit içermesini de etkiler.

Bu arada, Gram negatif bakteriler, bakterilerin Gram pozitif olanlardan daha az kompleks oluşturmasına neden olan ince bir peptidoglikan katmanına sahiptir.

Ardından, Gram pozitif ve Gram negatif bakterilerin farklı davrandığı renk değiştirme adımı gelir.

Gram negatif bakteriler, hücre duvarlarının bir parçası olan lipopolisakkaritler bakımından zengin bir dış zar içerir. Yağlar, aseton alkol ile temas yoluyla yok edilir, böylece dış zar, mor kristali serbest bırakarak dengesiz hale gelir.

Bu, daha sonra safranin veya temel fuksin ile kırmızıya dönüşen nasıl karşı konulduğudur.

Gram pozitif bakteriler söz konusu olduğunda, ağartıcı gözenekleri kapatarak çalışarak kristal viyole / iyot kompleksinin dışarı sızmasını önlediği için solmaya direnirler.

Bu nedenle, kristal menekşe ile renklenme sabit kalır ve safranin veya fuksin için yer yoktur. Bu bakterilerin koyu mavi veya mor lekelenmelerinin nedeni budur.

malzemeler

Gram'ın boyama seti şunlardan oluşur:

• Menekşe cam
• Lugol
• Aseton alkol
• Safranin veya temel fuksin

Boyalar ve reaktiflerin hazırlanması

Kristal menekşe çözeltisi

Çözüm:

Menekşe kristal ------------- 2 gr

Etil alkol% 95 ----------- 20cc

Çözüm B:

Amonyum oksalat ----------- 0.8 gr

Distile su ------------- 80 cc

Kristal viyole son hazırlığı için, çözelti A 1:10 damıtılmış su ile seyreltilmeli ve 4 parça B çözeltisi ile karıştırılmalıdır. Karışım, kullanımdan önce 24 saat saklanır. Filtre kağıdı kullanarak kehribar renkli bir şişeye süzün.

Günlük kullanılacak miktar amber renkli damlalıklı şişeye aktarılır.

İyodo-Lugol

Her bileşiğin belirtilen miktarını aşağıdaki gibi tartın ve ölçün:

İyot kristalleri ------------- 1gr

Potasyum iyodür ------------- 2gr

Distile su ------------- 300 cc

Potasyum iyodür suda azar azar çözünür ve ardından iyot eklenir. Çözelti, kehribar renkli bir şişeye tıraşlanır.

Günlük kullanılacak miktar damlalıklı daha küçük amber şişeye aktarılır.

Ağartma

% 95 Etil Alkol -----------– 50 ml

Aseton ------------------ 50 ml

Eşit parçalar halinde hazırlanır. Buharlaşma eğiliminde olduğundan iyice örtün.

Damlalıklı bir şişeye koyun.

Bu hazırlık 5-10 saniye içinde orta bir sürede renk değişikliği sağlar ve en çok tavsiye edilenidir.

Yeni başlayanlar, solmanın 10 ila 30 saniyeden daha yavaş olduğu yerlerde yalnızca% 95 etil alkol kullanmayı tercih eder.

Daha deneyimli olanlar saf aseton kullanabilirken, renk değişikliğinin 1 ila 5 saniye arasında çok hızlı gerçekleştiği yerlerde.

Kontrast

Safranin Stok Çözümü

Safranina -------------– 2,5 gr

Etil alkol% 95 --------– 100 cc

Belirtilen miktarda safranin tartıldıktan sonra 100 ml% 95 etil alkol içinde çözülür.

Çalışan safranin solüsyonu stok solüsyonundan hazırlanır.

Bunu yapmak için, 10 cc stok solüsyonu ölçün, 100 ml yapmak için 90 cc distile su ekleyin.

Günlük kullanılacak miktarın damlalıklı amber şişeye aktarılması tavsiye edilir.

Bazı anaeroblar, Legionella sp, Campylobacter sp ve Brucella sp gibi Gram-Hucker boyası ile zayıf Gram negatif boyayan mikroorganizmalar, Kopeloff'un Gram-Hucker boyası modifikasyonu kullanılarak çok daha iyi boyanabilir. Gram-Kopeloff boyası denir.

Bu teknik, safranin boyasını temel fuksine dönüştürür. Bu modifikasyon ile, yukarıda bahsedilen mikroorganizmaları etkili bir şekilde renklendirmek mümkündür.

Reaktif saklama

Hazırlanan renklendiriciler oda sıcaklığında saklanmalıdır.

Renklendirilecek numunenin smearinin hazırlanması

Bir numune, en azından 10 içermelidir ⁵ bir Yayma mikroorganizmanın gözlem öncesinde muhtemel mikroorganizmalar. Smearlar direkt numuneden veya katı veya sıvı ortamdaki kültürlerden yapılabilir.

Mevcut yapıların daha iyi görselleştirilmesi için lekeler tek tip olmalı, iyi dağıtılmalı ve çok kalın olmamalıdır.

-Doğrudan numune gram

Santrifüj edilmemiş gram idrar

İdrar karıştırılır ve 10 µl lam üzerine yerleştirilir. En az bir bakteri / Dip alanı gözlemlenmesi, bir enfeksiyon olduğunu gösterir.

Kültür, bağıl CFU 100.000 sahip olacağı Bu araçlar / ml (10 ⁵ vakaların% 85 idrar CFU / mL).

Bu yöntem, 100.000 CFU'nun altındaki koloni sayımları için kullanışlı değildir.

CSF Gram

CSF santrifüjlenmeli, süpernatan çıkarılmalı ve pelet bir slayt üzerine yayılmalıdır. Bu sıvı, normal koşullar altında sterildir; bakteri gözlemi enfeksiyonu gösterir.

Gram solunum örnekleri

Balgam, bronşiyal veya bronkoalveolar lavaj Gram, çeşitli mikroorganizmalar bulunabilmesine rağmen, gözlemlenen hücre tipine yararlı olmasının yanı sıra her zaman tanıya rehberlik edecektir.

Balgam durumunda, smear numunenin en pürülan kısımları ile hazırlanmalıdır.

Gram dışkı

Tanı değeri olmadığından, bu tür örneklerde Gram yapılması önerilmez.

- Mahsul gamı

Biri sıvı kültürlerden diğeri katı kültürlerden olmak üzere iki şekilde yapılabilir.

Sıvı kültürler

Sıvı kültürlerden bu son derece basittir; Bulanık et suyunun birkaç kavrulması brülörün altına alınır ve malzemeyi eşit olarak dağıtmak için merkezden çevreye doğru dairesel hareketler yaparak temiz ve kuru bir slayt üzerine yerleştirilir.

Havada kendiliğinden kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra malzeme levhaya ısı ile sabitlenir. Bunun için cımbız yardımı ile sac, malzemeyi yakmamaya özen gösterilerek Bunsen brülörünün alevi içinden 3-4 kez geçirilir.

Tabaka soğumaya bırakılır ve renklendirme köprüsüne yerleştirilir.

Katı ürünler

Katı bir kültürden Gram boyası için smear yapmak için aşağıdaki şekilde devam edin:

Alınacak kolonileri seçmeden önce, yaklaşık iki damla steril fizyolojik salin solüsyonu koyarak slayt hazırlanmalıdır.

Orijinal kültür plakası birkaç farklı tipte koloni içeriyorsa, Gram gerçekleştirmek için her birinin izole bir koloni seçilecektir. Her bir koloni, daha önce lam üzerine yerleştirilmiş salin solüsyonunda çözünmesi için platin öze ile alınacaktır.

Koloniyi slayt üzerinde homojen bir şekilde dağıtmak için merkezden çevreye doğru dairesel hareketler yapılır.

Havada kendiliğinden kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, levha, daha önce açıklandığı gibi (çakmakla sürgüyü ateşleyerek), malzemeyi yakmamaya özen göstererek ısıyla sabitlenir.

Bu prosedür, her farklı koloni tipinde yapılmalıdır. Bir kağıt parçasına, gözlenenlerin sırası not edilmelidir, örneğin:

Koloni 1: Beta-hemolitik sarı koloni: Kümelerde Gram pozitif koklar gözlendi

Koloni 2: Krem renkli, hemolizsiz koloni: Gram negatif kokobasiller gözlenmiştir.

Neyi gözlemlediğimizi bilmek için her slayt etiketlenmelidir.

Teknik

Gram boyama tekniğinin uygulanması son derece kolaydır ve nispeten ucuzdur ve bir mikrobiyoloji laboratuvarında kaçırılamaz.

Aşağıdaki gibi yapılır:

1. Sürüntüyü ısı ile sabitleyin ve boyama köprüsüne yerleştirin.
2. Slaytı 1 dakika boyunca kristal menekşe ile tamamen kapatın.
3. Su ile yıkayın Kurutmayın
4. Yaprağı lugol solüsyonuyla örtün, 1 dakika etki etmesini bekleyin. Su ile yıkayın Kurutmayın.
5. Alkol aseton içinde hafifçe sallayarak 5-10 saniye ağartın. Veya, levhayı dikey bir konuma yerleştirin ve renk gidericinin damlalarını, lekesiz mor camın fazlası çıkarılana kadar yüzeye bırakın. Aşmayın.
6. Su ile yıkayın Kurutmayın.
7. Slaytı boyama köprüsünde değiştirin ve 30 saniye boyunca safranin (Gram-Hucker) ile veya 1 dakika boyunca temel fuksin (Gram-Kopeloff) ile kapatın.
8. Su ile yıkayın
9. Dik konumda kendiliğinden kurumasını bekleyin.

Kuruduktan sonra, ışık mikroskobunda 100X objektifin altında gözlemlemek için 1 damla daldırma yağı koyun.

Yarar

Bu teknik, çoğu bakterinin morfotintoryal farklılıklarını ayırt etmeyi sağlar.

Mayalar da bu renklendirme ile ayırt edilir. Kristal menekşeyi alıyorlar, yani Gram pozitif boyuyorlar.

Öte yandan, sporlar iyi boyanmasa da endosporun oluştuğu basil içinde açık bir alanın gözlendiği spor oluşturan Gram-pozitif basiller ayırt edilebilir. Sporları boyamak için Shaeffer-Fulton gibi diğer teknikler kullanılır.

Bu boyamanın her tür bakteri renklendirmek için kullanılmadığı, yani boyamanın işe yaramadığı durumlar olduğu unutulmamalıdır.

Bu durumda hücre duvarı olmayan bakterilerden bahsedilebilir. Örneğin: cins Mycoplasma, sferoplastlar, ureaplasma, L-formları ve protoplastlar.

Ayrıca, Mycobacteria gibi mikolik asitler açısından zengin duvarlara sahip çok kötü bakterileri ve Chlamydias ve Rickettsias gibi hücre içi bakterileri boyar.

Çoğu spiroketal bakterinin boyanmasında da etkisizdir.

Gram pozitif ve Gram negatif olarak aynı örnekte görülebilen aynı cinsten bakteriler vardır. Bu gerçekleştiğinde buna değişken Gram boyama denir ve bu durum besinler, sıcaklık, pH veya elektrolit konsantrasyonundaki değişiklikten kaynaklanabilir.

Yaygın hatalar

Abartılı ağartma

Renk değiştirme adımındaki abartı, yanlış Gram negatif mikroorganizmaların gözlemlenmesine yol açabilir.

Daldırma yağı eklemek için yeterince uzun kuruma süresi beklememek

Gram pozitif bakterilerin Gram negatif (yanlış Gram negatif) boyamasına neden olabilir. Bunun nedeni, eski kültürlerde muhtemelen ölü veya bozulmuş bakteri bulunması ve bu koşullar altında bakterilerin kristal moru tutmamasıdır.

Çok eski bir lugol solüsyonu kullanın:

Zamanla lugol özelliklerini kaybeder ve rengi solar. Zaten dejenere olmuş reaktif kullanılırsa, kristal menekşeyi iyi sabitlemeyecektir, bu nedenle yanlış Gram negatif mikroorganizmaların görselleştirilmesi olasılığı vardır.

Mavi arka plan

Düzgün renksiz bir arka plan kırmızı olacaktır. Mavi bir arka plan, renk değişikliğinin yetersiz olduğunu gösterir.

Referanslar

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Tıbbi Mikrobiyoloji, 6. baskı McGraw-Hill, New York, ABD
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiyolojik Tanı. (5. baskı). Arjantin, Editoryal Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Arjantin. Editoryal Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Genel Mikoloji. 2. Baskı Venezuela Merkez Üniversitesi, Kütüphane Yayınları. Venezuela Karakas.
5. "Gram boyası." Vikipedi, bedava ansiklopedi. 4 Ekim 2018, 23:40 UTC. 9 Aralık 2018, 17:11. Es.wikipedia.org adresinden alınmıştır.
6. González M, González N. 2011. Tıbbi Mikrobiyoloji El Kitabı. 2. baskı, Venezuela: Carabobo Üniversitesi medya ve yayın müdürlüğü.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Mikrobiyoloji laboratuvarındaki temel boyalar. Engellilik Araştırması. 2014; 3 (1): 10-18.