STANDART AGAR BONCUK: MANTIK, HAZIRLIK VE KULLANIMLAR - BIYOLOJI - 2025

Ağar, standart olan bir non - Aerobik içme suyu örnekleri, atık su, sütlü içecekler ve diğer gıdalarda mikrobiyal yük mevcut ölçümü için tasarlanmış seçici, katı kültür ortamı. Bu besiyeri, English Plate Count Agar'daki kısaltması nedeniyle PCA agar olarak da bilinir. 1953'te Buchbinder, Barış ve Goldstein tarafından oluşturuldu.

Standart sayım agar ortamı maya özütü, triptein, glikoz, agar ve damıtılmış sudan oluşur. Bu formülasyon, zorlu olmayan mevcut aerobik mikrobiyal yükün gelişmesine izin veren temel besin öğeleri içerir.

Standart agar sayımlarında CFU'ları saymak için ondalık dilüsyonlar. Kaynak: Quentin Geissmann

Besiyeri inhibitör içermediğinden, bakteriler herhangi bir kısıtlama olmaksızın büyüyebilir ve bu da onu genel koloni sayımı için ideal kılar. Bununla birlikte, plak kantifikasyon tekniği mevcut tüm bakterileri değil, yalnızca tohumlanmış standart sayım agarının tabi olduğu çevresel koşullar altında büyüyebilenleri tespit edecektir.

Bu anlamda, plaka kantifikasyon tekniği genellikle aerobik mezofilik tipteki, yani 37 ° C'lik optimum büyüme sıcaklığı ile 25 ila 40 ° C arasındaki sıcaklıklarda büyüyen bakteri miktarını belirlemeye çalışır. .

Bu bakteri grubu çok önemlidir, çünkü insan için patojenik bakterilerin çoğu orada bulunur.

Bazen gıdada bulunan psikrofilik bakteri miktarını ölçmenin ilginç olabileceği unutulmamalıdır. Bu bakteriler, düşük sıcaklıklarda (<20 ° C) büyüyen ve buzdolabında bile olsa yiyeceklerin daha hızlı ayrışmasına neden olan bakterilerdir.

Benzer şekilde, 50 ° C ila 80 ° C veya daha fazla bir aralıkta gelişen termofilik bakteriler, konserve yiyecekler gibi belirli gıda türlerinde önemli olabilir.

Mikrobiyal kantifikasyon, gram veya mililitre numune başına koloni oluşturan birimler (CFU) cinsinden ifade edilir.

temel

Standart sayım ortamı, maya ekstraktı, triptein ve glikoz iyi mikrobiyal büyüme için gerekli besinleri sağladığından güç üreyen aerobik olmayan bakterilerin başarılı bir şekilde büyümesine izin verecek şekilde tasarlanmıştır.

Diğer yandan besiyeri açık bir renge ve şeffaf bir görünüme sahiptir, bu nedenle derin tohumlama yöntemiyle (bir tabağa dökerek) geliştirilen kolonilerin görselleştirilmesi için idealdir.

Drigalski spatula yüzey tohumlama yöntemiyle koloni sayımı da mümkündür.

Mikrobiyal yük yüksek olduğunda, CFU'ları sayabilmek için çalışma numunesinin ondalık dilüsyonları yapılmalıdır.

Bu besiyerinin aerobik mezofillerin sayımı için Amerikan Halk Sağlığı Derneği (APHA) tarafından önerildiği unutulmamalıdır.

Hazırlık

23.5 g susuz ortam tartılır ve bir litre damıtılmış su içinde çözülür. Tamamen çözünmesi için karışımın kaynayana kadar sık ​​sık karıştırılarak ısıtılması gerekir. Sonraki alt adımlar, kullanılacak tohumlama tekniğine bağlıdır.

Dökme plaka tekniği için

Test tüplerine 12 ila 15 ml dağıtarak dağıtın. Daha sonra otoklavda 121 ° C'de 15 dakika sterilize edin. Bir blok şeklinde dikey olarak katılaşmasına izin verin. Kullanana kadar buzdolabında saklayın.

Fişi kullanacağınız zaman eritin. Eritildikten sonra numuneler hazırlanırken 44-47 ° C'de su banyosunda bekletilir.

Yüzey ekimi için

Otoklavda 121 ° C'de sterilize edin ve ardından steril Petri kaplarına 20 ml dağıtın. Katılaşın, ters çevirin ve kullanıma kadar buzdolabında saklayın.

Kullanmadan önce plakaları temperleyin. Ortamın pH'ı 7.0 ± 0.2 olmalıdır.

kullanım

Standard Count Agar, su ve gıdanın mikrobiyolojik analizi sırasında aerobik mezofilik sayım tekniğinde kullanılır. İncelenen numunenin sıhhi kalitesini belirlediği için aerobik mezofillerin sayısı gereklidir.

Bu tekniğin uygulanması (bu besiyerinin kullanılması), kantifikasyonları için izole edilmiş kolonilerin makroskopik olarak görüntülenmesine izin verir.

Plaka dökme tekniği (derinlemesine tohumlama)

-Süreci

Teknik aşağıdakilerden oluşur:

1) Mevcut bakterileri yeniden dağıtmak için numuneyi homojenize edin.

2) 90 ml seyreltici ( ^10-1 ) içindeki 10 gr veya 10 ml numune oranına göre steril bir şişe veya torba içinde bir başlangıç ​​süspansiyonu yapılır .

3) İlk süspansiyondan, numunenin tipine bağlı olarak ilgili ondalık dilüsyonlar yapılır. Ör: ( ^10-2 , ^10-3 , ^10-4 ). Seyreltmeler pepton su veya fosfat tamponu ile yapılır.

Bunu yapmak için, 1 ml ilk süspansiyon alın ve 9 ml seyreltici içine koyun, gerekirse seyreltmeye devam edin, şimdi 1 ml ^10-2 seyreltme vb.

4) Her dilüsyondan 1 ml alın ve boş steril Petri kaplarına koyun.

5) Her plakaya önceden eritilmiş ve 44 - 47 ° C'ye yerleştirilmiş 12 ila 15 ml standart sayım agarı ekleyin.

6) Örneği agar boyunca eşit bir şekilde dağıtmak ve katılaşmasına izin vermek için plakaları yavaşça döndürün.

7) Plakları ters çevirin ve 37 ° C'de aerobiosis içinde 24 ila 48 saat inkübe edin.

8) Süre sonunda plaklar incelenir ve buna izin veren seyreltmede koloniler sayılır. Sayım için 30 ila 300 CFU arasında olan plakalar seçilir.

Sayım manuel olarak yapılabilir veya koloni sayacı ekipmanını kullanabilirsiniz.

Numune ml'si başına izin verilen değerler, tabi oldukları yönetmeliklere bağlı olarak bir ülkeden diğerine değişebilir.

-UFC'nin hesaplanması

Genel hesaplama aşağıdaki formül kullanılarak yapılır:

CFU'ların kantifikasyonunun genel hesaplaması için formül. Kaynak: Ulusal İlaç, Gıda ve Tıp Teknolojisi İdaresi (ANMAT). Gıdanın mikrobiyolojik analizi, resmi analitik metodoloji, gösterge mikroorganizmalar. 2014 Cilt 3. Şu adresten ulaşılabilir: anmat.gov.ar

Sonuçları 1 veya 2 basamaklı olarak uygun 10 tabanıyla çarparak ifade edin. Örnek: sonuç 16.545 ise, üçüncü basamağa göre 17.000'e yuvarlanır ve şu şekilde ifade edilir: 1.7 x 10 ⁴ . Şimdi, sonuç 16.436 ise, 16.000'e yuvarlayın ve 1.6 x 10 ^4'ü ifade edin .

Yüzey tohumlama tekniği

-Süreci

Doğrudan numune 0.1 ml -Inocular başlangıçtaki süspansiyon 10, sıvı ise ^-1 ya da birbirini takip eden dilüsyon 10 ^-2 10, ^-3 plaka agar standart sayısı merkezinde, vb.

-Örneği Drigalski spatula veya L-şekilli cam çubuk ile eşit olarak dağıtın ve 10 dakika dinlendirin.

-Plakları ters çevirin ve aerobik olarak 37 ° C'de 24 ila 48 saat inkübe edin.

-Kolonileri saymaya devam edin, 20-250 CFU aralığında olan plakaları seçin.

-UFC'nin hesaplanması

Hesaplama için, tersi olan seyreltme faktörü uygulanır. Sayı 2 anlamlı basamağa yuvarlanır (üçüncü basamağa göre yuvarlanır) ve 10 tabanının kuvvetiyle ifade edilir. Örneğin, numunede seyreltilmeden 224 CFU sayılırsa ( ^10-1 ), 22 x 10 ¹ CFU bildirilir , ancak rakam 225 ise, 23 x 10 ¹ CFU rapor edilir.

Şimdi 199 CFU 10'da sayılır eğer ^-3 seyreltme , 20 x 10 ⁴ CFU rapor edilecektir, ancak 153 halinde CFU 15 x 10, aynı seyreltme sayılır ⁴ CFU rapor edilecektir.

QA

Standart sayım kültür ortamı, Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022 gibi bilinen sertifikalı suşlar kullanılarak değerlendirilebilir.

Kültür ortamı optimal koşullarda ise, düzenli bir verime sahip olabilen L. fermentum hariç tüm durumlarda tatmin edici büyüme beklenir.

Kültür ortamının sterilitesini değerlendirmek için, hazırlanan her partiden (aşılama olmaksızın) bir veya iki plak 24 saat aerobiosis içinde 37 ° C'de inkübe edilmelidir. Bu sürenin sonunda besiyerinde üreme veya renk değişikliği gözlenmemelidir.

Sınırlamalar

-Ağarı birden fazla eritmeyin.

-Hazırlanan besiyeri buzdolabında saklandığı ve ışıktan korunduğu sürece 3 aya kadar dayanabilir.

-Bu besiyeri, zorlu veya anaerobik mikroorganizmalar için uygun değildir.

Referanslar

1. Ulusal İlaç, Gıda ve Tıp Teknolojisi İdaresi (ANMAT). Gıdanın mikrobiyolojik analizi, resmi analitik metodoloji, gösterge mikroorganizmalar. 2014 Cilt 3. Şu adresten ulaşılabilir: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Count Agar. 2009. Şu adresten ulaşılabilir: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa Laboratuvarları. APHA ve ISO 4833'e göre Standart Metot Agar (PCA). Condalab.com'da bulunabilir.
4. Britannia Laboratuvarları. Agar plak sayısı. 2015. britanialab.com'da bulunabilir
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B ve Velázquez O. 2009. Gıdaların Mikrobiyolojik Analizi için Teknikler. 2. baskı Kimya Fakültesi, UNAM. Meksika. Depa.fquim.unam adresinde mevcuttur