LÖWENSTEIN-JENSEN ORTAMI: TEMEL, HAZIRLIK VE KULLANIM - BIYOLOJI - 2025

Lowenstein-Jensen ortamı kültüre değildir lepra türlerinin hariç, diğerleri arasında, Mycobacterium tuberculosis, M. avium gibi cinsi Mycobacterium bakterilerin izolasyonu ve gelişme için seçici bir katı ortamdır.

Mycobacterium cinsinin bakterileri geleneksel kültür ortamında üremediğinden izolasyonları için özel bir ortam tasarlamak gerekliydi. Orijinal ortam Löwenstein tarafından oluşturulmuş ve daha sonra Jensen tarafından değiştirilmiştir.

Mycobacterium tuberculosis kolonileri içeren Löwenstein-Jensen besiyeri. Kaynak: Agarwal ve diğerleri / BioMed Central Ltd., Biology Image Library'nin izniyle

Modifikasyon, Kongo kırmızı boyasının ortadan kaldırılması ve bunun yerine daha yüksek bir malakit yeşili konsantrasyonu ile değiştirilmesinden oluştu. Ayrıca magnezyum sitrat ve monopotasyum fosfat konsantrasyonlarını da değiştirdi.

Löwenstein-Jensen besiyeri şu anda patates nişastası, asparajin, magnezyum sitrat, monopotasyum fosfat, magnezyum sülfat, malakit yeşili, nalidiksik asit, sikloheksimid, linkomisin, çırpılmış yumurta, gliserin ve su içerir.

Mikobakteriler normalde diğerlerinin yanı sıra balgam, idrar, apse gibi steril olmayan bölgelerden izole edilir. Bu, örneklerin çoğunun bölgenin normal mikrobiyotasını ve patojeni içereceği anlamına gelir.

Bu nedenle, Löwenstein-Jensen besiyeri, bileşiminde malakit yeşili, antibiyotikler ve antifungaller ile temsil edilen bir dizi inhibitör içerir.

Ayrıca, steril olmayan alanlardan gelen numuneler, Löwenstein-Jensen besiyerine ekilmeden önce dekontamine edilmeli ve nötralize edilmelidir.

temel

Löwenstein-Jensen besiyerinde yumurta ve gliserin varlığı, bu mikroorganizmaların gelişimi için gerekli olan yağ asitlerini ve proteinleri sağladıkları için mikobakterilerin büyümesini uyarır.

Löwenstein-Jensen besiyeri, eşlik eden mikrobiyotanın bir inhibitörü olan malakit yeşili içerir. Ama aynı zamanda Gram negatif mikrobiyotayı inhibe eden nalidiksik asit (35 µg / mL), saprofitik mantarlar ve mayaları inhibe eden sikloheksimid (400 µg / mL) ve Gram pozitif mikrobiyotayı inhibe eden lincomycin (2 µ / mL) içerir.

Bazı ticari evler aşağıdaki antibiyotik kombinasyonunu eklemeyi tercih eder: polimiksin B 200.000 ünite / L, amfoterisin B 10 mg / L, karbenisilin 50 mg / L ve trimetoprim 10 mg / L.

Bu besiyeri agar içermez, bu nedenle besiyerinin katılaşması, sterilizasyon sırasında yumurtada bulunan albüminin pıhtılaşması nedeniyle oluşur.

Hazırlık

Önceden 12 ml gliserol ilave edilmiş olan 600 ml distile su içinde 37.3 g susuz ortam tartılır. Karışım tamamen eriyene kadar sık ​​sık karıştırılarak ısıtılır. Ortamı 121 ° C'de 15 dakika otoklavlayın.

Öte yandan, aseptik koşullar altında homojen bir 1000 ml taze yumurta süspansiyonu hazırlanmalıdır. Yumurta süspansiyonunu 50 - 60 ° C sıcaklıkta hazırlanan 600 ml besiyerine hava kabarcıklarından kaçınarak ekleyin.

Otoklavda sterilizasyondan sonra antibiyotik solüsyonları da eklenir.

Besiyerini, vidalı kapaklı steril test tüplerine dökün. Tüpleri eğimli bir konumda 85 ° C'de 45 dakika ısıtın.

Hazırlanan besiyerinin rengi akuamarin yeşilidir ve yumurta lipidlerinin varlığından dolayı beyazımsı lekeler oluşturabilir.

Ortamın pH'ı 7.2 ± 0.2 olmalıdır

Tüpleri bir buzdolabında ve kullanıma kadar doğrudan ışıktan koruyarak saklayın. Ekimden önce tavlayın.

Ortamda "Löwenstein Jensen'in Gruft modifikasyonu" adı verilen bir modifikasyon var. Bu, klasik ortamla aynı bileşikleri içerir, ancak RNA-5mg / 100 mL eklenir ve inhibitörler olarak malakit yeşili 0.025 g / 100 mL, penisilin 50 U / mL ve nalidiksik asit 35 ug / mL içerir.

Uygulamalar

Löwenstein-Jensen besiyeri, çeşitli örnek türlerinden mikobakterilerin izolasyonu için kullanılır. Mikobakterilerin varlığından şüphelenilen tüm örnekler için Ziehl-Neelsen boyası önerilir.

Bazı numuneler steril yerlerden gelir, ancak diğerleri gelmez. Steril olmayan numuneler uygun şekilde dekontamine edilmelidir:

Balgam

Balgam numuneleri aşağıdaki şekilde dekontamine edilmelidir: balgam numunesinin miktarını ml cinsinden belirleyin ve numuneye aynı miktarda% 4 NaOH ekleyin ve 37 ° C'de inkübe edin.

Karışımı 30 dakika içinde sık sık sallayın. Ardından 30 dakika boyunca 3000 RPM'de santrifüjleyin.

Süpernatantı bir fenolik dezenfektan solüsyonu üzerine atın. Sedimenti ekim için kullanın, ancak önce pH'ın nötralize edilmesi gerekir.

Sedimenti nötralize etmek için, somon rengi üreten nötr bir pH'a ulaşana kadar fenol kırmızısı indikatörün varlığında% 5 H ₂ SO ₄ kullanılır .

Mide yıkama, bronşiyal lavaj ve bronşiyal aspirat

Bu durumda örnek 30 dakika 3000 RPM'de santrifüjlenmelidir. Süpernatan atılır ve pelet kullanılır. Sedimenti dekontamine etmek için 3 ml% 4 NaOH ekleyin ve sık sık 37 ° C'de yarım saat süreyle karıştırın.

Tekrar santrifüjleyin, süpernatan atılır ve pelet kullanılır. İkincisi, balgam örneğinde açıklandığı gibi nötralize edilmelidir.

İdrar

Numuneyi 24 saat buzdolabında bekletin. Süpernatantı ayırın. Kalan pelet 30 dakika 3000 RMP'de santrifüjlenmelidir. Süpernatantı tekrar atın ve pelleti 3 ml steril fizyolojik solüsyonla sulandırın.

3 ml% 4 NaOH ekleyin ve daha önce anlatıldığı gibi dekontaminasyon ve nötralizasyon işlemlerine devam edin.

Asit sıvısı, plevral sıvı, beyin omurilik sıvısı

Bu tip numunede santrifüjlenir ve süpernatan atılır. Tortu üzerinde bir Gram uygulayın veya doğrudan mikroskop altında gözlemleyin; Bakteriler gözlenmezse, dekontaminasyon adımı veya nötralizasyon adımı gerekli değildir.

Bu durumda, numune doğrudan tortu kullanılarak tohumlanabilir. Bakteri varsa, yukarıda açıklandığı gibi dekontamine edin ve nötralize edin.

biyopsiler

Bu tür numuneye, daha sonra 1500 RPM'de 10 dakika santrifüj için 5 ml distile su ilave edilmelidir. Süpernatantı atın ve pelleti 30 dakika 3500 RPM'de yeniden santrifüjleyin. Kültür ortamını ekmek için tortuyu kullanın.

Laringeal sürüntü

Swab, eşit miktarda distile su ve% 4 NaOH içeren steril bir tüpe yerleştirilmelidir. Swab, numunenin sıvıda seyreltilmesi için tüpün duvarlarına bastırılmalıdır. Santrifüjleyin ve tortuyu kullanın. Tortuyu daha önce tarif edildiği gibi nötralize edin.

ekilen

Löwenstein-Jensen besiyeri, besiyerinin yüzeyine 0,5 ml örnek eklenerek aşılanır. Örneği besiyeri boyunca dağıtmak için tüpü döndürün. Platin kulp kullanmayın.

Mycobacterium bovis ve Löwenstein-Jensen besiyerinde büyümeyen diğer türleri izole etmek için Stonebrink ortamı içeren ikinci bir tüp tohumlanabilir.

Kuluçka

İnoküle edilmiş tüpler, kapağı hafifçe gevşek ve yaklaşık 5 ° eğimli olacak şekilde 37 ° C'de aerobik olarak inkübe edilir ve ışıktan korunur. Çevre,% 5–10 karbondioksit ile zenginleştirilebilir. Koloniler görünene kadar kültürleri haftada iki kez kontrol edin.

Numune emildiğinde, kapaklar sıkılır. Maksimum inkübasyon süresi 8 haftadır, bu süreden sonra üreme olmazsa negatif olarak rapor edilir.

QA

Aşağıdaki suşlar kalite kontrol olarak kullanılabilir:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 32015, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus piyogenes

M. fortuitum için büyümenin iyi olması gerekirken, M. bovis için çok az büyüme beklenmekte veya hiç beklenmemektedir. Bu arada, Mycobacterium cinsi dışındaki türler tamamen inhibe edilmelidir.

Sınırlamalar

Hazırlanan ortam ışıktan korunmalıdır, ışığa uzun süre maruz kalmak ortamın yeşilden maviye dönmesine neden olur, bu durumda ortam artık kullanılamaz. Bunun nedeni malakit yeşilinin ışığa duyarlı olmasıdır.

Besiyeri, yumurta içerdiğinden, aseptik olarak kullanılmazsa kolayca kontamine olabilir. Proteolitik bakterilerle kontamine olursa çözülebilir.

Mycobacterium cinsi bakterilerin yetiştirilmesi ve kullanılması, kontamine olmaktan veya başkalarını kontamine etmekten kaçınmak için izlenmesi gereken biyogüvenlik önlemlerinin farkında olan kalifiye personel gerektirir.

Koch basiline toksik olabilen sodyum klorür oluşumu nedeniyle nötralizasyon aşamasında HCl kullanılmamalıdır.

Örnekler işlenmeden buzdolabında saklanmalı ve ışıktan korunmalıdır.

Referans

1. Francisco Soria Melguizo Laboratuvarları. 2009. Löwenstein-Jensen seçici ortam. Mevcut: f-soria.es
2. Britannia Laboratuvarları. 2017. Löwenstein-Jensen ortamı. Britanialab.com'da mevcuttur.
3. Neogen Laboratuvarları. Löwenstein-Jensen ortamı. Şu adreste bulunabilir: foodafety.neogen.com.
4. "Löwenstein-Jensen ortamı." Vikipedi, bedava ansiklopedi. 20 Kasım 2018, 15:15 UTC. 24 Nisan 2019, 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiyolojik Tanı. 5. baskı. Editoryal Panamericana SA Arjantin.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Mikrobiyolojik Tanı. 12 ed. Editoryal Panamericana SA Arjantin.
7. Mac Faddin J. (2003). Klinik önemi olan bakterilerin tanımlanması için biyokimyasal testler. 3. baskı Editör Panamericana. Buenos Aires. Arjantin.