DNA DIZILEME: MAXAM-GILBERT, YÖNTEM VE ÖRNEKLER - BIYOLOJI - 2025

DNA dizilemesi (deoksiribonükleik asit) sağlar moleküler biyoloji laboratuarlarında işlemdir için ilgi konusu genetik malzemenin nükleotidlerin sırasını biliyoruz. Ayrıca, RNA'nın (ribonükleik asit) sekanslanması da açıklanabilir.

Bu teknik, biyolojik bilimlerin gelişmesi için vazgeçilmez olmuştur. Aynı zamanda, örneğin tıbbi teşhis ve adli tıp araştırmaları gibi diğer bilgi alanlarına da uygulanabilir.

Kaynak: Pixabay.com

Önceden, bir DNA zincirinin dizilenmesi, oligonükleotidlerde sadece birkaç baz çiftinin tanımlanmasına izin veren yavaş ve pahalı bir aktivite olarak kabul ediliyordu.

Günümüzde bilimdeki tüm ilerlemelerle birlikte DNA dizileme, bu alandaki neredeyse 50 yıllık araştırmaların katkısı sayesinde dünya çapında birçok laboratuvarda rutin bir işlemdir. Zincir uzunluğu açısından, çok kısa bir sürede milyonlarca baz çifti dizilenebilir.

Bunu yapmak için, fiyat ve hassasiyet açısından değişen düzinelerce teknik geliştirilmiştir. Bu yazıda, her birinin avantajları ve dezavantajları olan hem klasik hem de modern teknikleri anlatacağız.

Şimdiye kadar, dizileme teknikleri, küçük prokaryotlar ve mayalardan insan genomuna kadar tam genom dizisinin elde edilmesini sağlıyor.

DNA yapısı

DNA dizilemesi için kullanılan yöntemleri ve teknikleri anlamak için, molekülün yapısının ve bileşiminin belirli anahtar yönlerini bilmek gerekir.

DNA, bakterilerden büyük suda yaşayan hayvanlara kadar tüm canlılarda bulunan bir biyomoleküldür. Mitokondri ve kloroplastlar gibi organellerin içinde dairesel bir DNA molekülü vardır. Bazı virüslerde bile bulunan genetik materyal DNA'dır.

Yapısal olarak DNA, nükleotidlerin bir koleksiyonudur. Her biri bir karbonhidrat, azotlu bir baz (A, T, C veya G) ve bir fosfat grubundan oluşur. DNA dizilemesinin amacı, dizide dört azotlu bazın bulunduğu sırayı ortaya çıkarmaktır.

Tarih

1950'lerin ortalarında, araştırmacılar Watson ve Crick, DNA'nın yapısını kristolografik teknikleri kullanarak tanımladılar. Ancak, bu araştırmacıların hiçbiri diziyi çözmenin bir yolunu bulamadı.

Bazı öncülleri olmasına rağmen, en önemli olay 1977'de Sanger yönteminin oluşturulmasıydı. Yöntemin babası Frederick Sanger, biyolojik bilimlere yaptığı muazzam katkılardan dolayı iki Nobel ödülü kazanan bir İngiliz biyokimyacıydı.

Bu teknik, literatürde "zincir sonlandırma" veya dideoksinükleotidler olarak da bilinir. Bu tekniğin ilkeleri ve iyileştirilmesine ve yeniliğine dayalı olarak geliştirilenler aşağıda açıklanacaktır.

Sanger yöntemi

Sanger yönteminin geliştirilmesi, moleküler biyolojide çok önemli bir olayı temsil etti. Normalde hücrede meydana gelen DNA replikasyon sürecinin temel bileşenlerini içerir, ancak özel bir bileşen ekler: dideoksinükleotidler.

Reaksiyonun ana bileşenleri

- DNA polimeraz: DNA polimeraz enzimi, sürecin çok önemli bir unsurudur. Bu molekül, DNA zincirinin replikasyonuna katılır ve rolü, trifosfat deoksiribonükleotitleri tamamlayıcı olanlarla eşleştiren yeni ipliğin sentezidir.

DNA'da timinlerin (T) adeninler (A) ile iki hidrojen bağı yoluyla eşleştiğini, sitozinin (C) ise guanin (G) ile üç bağ yoluyla yaptığını hatırlayın.

- Nükleotidler: Sanger dizilemesi iki tür nükleotidi içerir, dört 2'-deoksinükleotid (dATP, dGTP, dCTP ve dTTP olarak kısaltılır) ve dört dideoksinükleotid (ddATP, ddGTP, ddCTP ve ddTTP).

Dideoksinükleotidler, normalde DNA'ya dahil edilen monomerlere benzer olmalarına rağmen, yapılarında bir -OH grubu yoktur. Bu, zincire yeni bir nükleotid eklemeyi imkansız kılar.

Bu nedenle, oluşum halindeki zincire - tamamen rastgele bir şekilde - özel bir nükleotid eklendiğinde, sentez felç olur. Bu nedenle reaksiyonun sonunda, her biri reaksiyonun farklı bir noktada durdurulduğu farklı boyutlarda zincirler vardır.

Deneysel olarak dört test hazırlanır. Her biri, ilgili biyolojik örnekten, normal nükleotidlerden ve dört özel nükleotid türünden ekstrakte edilen DNA'yı içerir. Ya özel nükleotidler, bir tür floresan işaretleyici ile işaretlenmiştir (aşağıdaki otomatik dizileme bakınız).

Sonuçları okumak

İlk adım, sentezlenen zincirlerin her birini boyutlarına göre ayırmaktır. Özel üslerin nerede bulunduğuna bağlı olarak bazıları diğerlerinden daha uzun olacaktır.

Boyutu ayırt edici bir özellik olarak kullanan bir karışımın bileşenlerinin ayrılmasına izin veren farklı biyokimyasal teknikler vardır. Sanger'in yönteminde, farklı zincirler elektroforez ile ayrılır. Tekniğin daha sofistike varyantlarında kapiler elektroforez kullanılır.

Böylece, daha uzun teller, kısa varyantlardan daha az hareket eder. Bu sistem daha sonra her bir dideoksinükleotidde bulunan markörü tanıyan bir okuyucudan geçer. Bu şekilde dizinin sırası bilinebilir.

Bu "birinci nesil" teknik, 1 kilobazdan büyük olmayan DNA parçalarını okuyabilir. Şu anda, Sanger yöntemi çeşitli laboratuvarlarda, genellikle modern varyantlarında kullanılmaktadır. Buna ek olarak, en karmaşık tekniklerle elde edilen sonuçları doğrulamak için kullanılır - ancak daha az kesin.

Otomatik sıralama

Büyük ölçekte sıralama gerektiğinde, süreç otomasyon yoluyla hızlandırılır. Bu, primerlerin ayırt edilmesi için floresan ürünlerle etiketlendiği Sanger zincir sonlandırma yönteminin bir çeşididir.

Daha sonra, reaksiyon ürünü, hepsi tek bir şeritte olmak üzere bir elektroforezde çalıştırılır. Her parça jelin son kısmından çıkarken,% 1'i çevreleyen bir hata ile floresan etiketlemesi ile hızlı bir şekilde tanımlanır.

En gelişmiş sistemler, bir robota bağlı bir bilgisayar tarafından yönetilen 96 adede kadar kapiler tüpten oluşan bir sisteme sahiptir. Yani 96 DNA örneği aynı anda test edilebilir. Böylece, elektroforez ve sonuçların analizini içeren süreç tamamen otomatiktir.

Bu sistemler bir günde 550.000 baza kadar sıralama yapabilir. İşlem sırasında insan emeği gereksizdir, yönteme başlamak sadece 15 dakika sürer.

Maxam-Gilbert sıralaması

Sanger çalışmalarını yayınlarken aynı zamanda Allan Maxan ve Walter Gilbert adlı iki araştırmacı, DNA dizisini elde etmek için başka bir yöntem geliştirmeyi başardı. Yöntem o sırada popülerlik kazandı, ancak daha sonra Sanger'in yönteminin geliştirilmesiyle yerini aldı.

Sanger yönteminin aksine, Maxan ve Gilbert dizileme (veya bilindiği üzere kimyasal dizileme) hibridizasyon reaksiyonlarını içermez. Metodoloji, bir uçta reaktif maddelerle etiketleme ve ardından bir saflaştırma işleminden oluşur.

Bu tekniğin olumsuz yönlerinden biri, muazzam karmaşıklığında ve kullanıcı için tehlikeli olan kimyasalların kullanımında yatmaktadır. Kimyasal kırılmalar, DMS, formik asit, hidrazin ve hidrazinin tuzlarla uygulanmasıyla indüklenir.

süreç

Protokol, ipliğin 5 'ucunda fosfor işaretleyici 32 ile etiketleme ile başlar, daha sonra nitrojen bazında kimyasal bir modifikasyon meydana gelir ve ayrılır. Son olarak, abasik bölgenin bölünmesi meydana gelir.

Önce, sıralamak istediğiniz dizeyi daha küçük parçalara kısaltın. Bu adım, çıkıntılı uçlarla sonuçlanan kısıtlama enzimleriyle gerçekleştirilir.

Daha sonra reaksiyon, amacı fosfat grubunu ortadan kaldırmak olan bir alkalin fosfataz ile gerçekleştirilir. Bu nedenle, etiketlemeyi gerçekleştirmek için bir polinükleotid kinaz kullanılabilir.

Zincir denatüre edilir (iki şerit açılır). Ardından kimyasallar uygulanır. Bu bölünme reaksiyonları kontrollü bir şekilde yapılır ve uygulanan her bir kimyasalın ne tür bağlar kırdığı bilinmektedir.

Sonuçları okumak

Sanger yönteminde olduğu gibi, sonuçların okunması, bir elektroforez sisteminde elde edilen zincirlerin boyutuna göre ayrılmasını içerir. Poliakrilamidden oluşan sistemler, jelin okunması için çok yeterli bir çözünürlüğe izin verir.

Kütle sıralaması

Büyük sıralama, İngilizce "Yeni Nesil Dizileme" den NGS olarak kısaltılmış bir dizi yeni yöntemi kapsar.

NGS olarak sınıflandırılan yöntemler, daha önce bir DNA amplifikasyon aşaması gerektirir (tek bir molekülle çalışmazlar). Ayrıca, kullanılan platformlar çok çeşitlidir. En popüler yöntemlerin ilkeleri aşağıda açıklanacaktır:

Pyrosequencing

DNA zincirine her yeni nükleotid eklendiğinde ortaya çıkan bir pirofosfat salınımının izlenmesini içerir. Bir enzim sistemi, yeni bir nükleotid dahil edildiğinde her seferinde (bir kamera tarafından tespit edilebilen) ışık yayılımının meydana gelmesi için birleştirilir.

İşlem, ışık emisyonunun olup olmadığını doğrulamak için her bir nitrojen bazının ayrı ayrı inkübasyonuyla başlar. Pyrosequencing uzun şeritleri okuyabilir, ancak bulunan hata oranı yüksektir.

Sentez sıralaması

Bu, etiketlenmiş nükleotitlerin dahil edilmesini içerir. Bu floresan bileşenler eklenir, yıkanır ve dahil edilen nükleotid not edilir. Daha sonra nükleotid etiketi çıkarılır ve ipliğin sentezine devam edilebilir. Bir sonraki adımda, etiketli bir nükleotid de dahil edilecek ve yukarıda bahsedilen adımlar tekrarlanacaktır.

Bu tekniğin bir dezavantajı, floresan işaretler tamamen çıkarılmadığında ortaya çıkar. Bu emisyonlar arka planda hatalar yaratarak önemli hatalara neden olur.

Ligasyon sıralaması

Bu teknik, DNA polimeraz kullanmadığı için diğerlerinden farklıdır. Bunun yerine, bu metodoloji için anahtar enzim ligazdır. Burada floresan etiketli DNA fragmanları kullanılır, enzim ile bağlanır ve tespit edilir.

Bu teknikle ilgili en büyük sorun, işleyebildiği kısa parça uzunluğudur.

Ion Torrent Sıralaması

Bu teknik, her yeni nükleotid eklendiğinde salınan H ⁺ iyonunun ölçümüne dayanmaktadır . İlke, pyrosequencing'e oldukça benzer, ancak çok daha ucuzdur.

Örnekler

İnsan genomunun dizilimi

İnsan genomunun sıralanması, biyolojide en umut verici zorluklardan biri olmasının yanı sıra bilim tarihindeki en çok beğenilen rekabetlerden biri olmuştur. Aslında, projeye dahil olan bilim adamları için genomun sıralanması bir rekabet haline geldi.

1990 yılında ünlü bilim adamı, Nobel Ödülü sahibi James Watson tarafından yönetilen "insan genomu projesi" olarak adlandırılan projeye başladı. Bir yıl sonra, 1991'de Venter, Watson'ı "yenme" ve önündeki genomu dizileme görevini üstlendi. Ancak 1992'de Watson emekli oldu ve komuta başka bir araştırmacı tarafından alındı.

1995 yılında Venter, bir bakteriyel genomun rastgele dizileme yöntemiyle tam dizilenmesindeki başarısını açıkladı. Benzer şekilde, rakip ekip bir yıl sonra maya genomunun dizilişini duyurdu.

2000 yılında derece sona erdirildi. Her iki şirket de ön tüm genom sonuçlarını bilimin en prestijli iki dergisinde yayınladı: Nature and Science.

Bununla birlikte, bilim adamları önerileri iyileştirmek için çalışmaya devam ettiler ve 2006'da bazı insan kromozomlarının dizileri tamamlandı.

Önemi ve uygulamaları

DNA gibi bu kadar önemli bir molekülün nükleotidlerinin sırasını bilmek biyologlar ve ilgili profesyoneller için değerlidir. Bu polinükleotid zinciri, tüm yaşam biçimlerinin gelişimi ve sürdürülmesi için gerekli tüm bilgileri içerir.

Bu nedenlerle, bu dizinin bilgisi biyolojik araştırma için gereklidir. Temel olarak, sıralama, biyolojik sistemlerin en önemli özelliklerinden birini ölçmeyi ve aralarında farklar kurmayı mümkün kılar.

Dizileme, taksonomistler ve sistematistler tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü belirli DNA dizileri, iki organizmanın aynı türe ait olup olmadığına karar vermek için kriterler oluşturmaya izin verir ve aralarındaki filogenetik ilişkiler hakkında hipotezler önerebilir.

Ek olarak, DNA diziliminin tıpta ve teşhis alanında uygulamaları vardır. Örneğin, sekanslama yoluyla, sözde tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) kullanarak belirli hastalıkları (kanser gibi) geliştirme eğilimini değerlendirmeyi mümkün kılan ucuz ve erişilebilir sistemler vardır.

Suçlu ve adli tıp türünün soruşturmaları, belirli bir bireyin bir suça katılımının güvenilir kanıtı olarak kullanılabilecek sıralama teknikleriyle de zenginleştirilmiştir.

Referanslar

1. Heather, JM ve Chain, B. (2016). Sıralayıcı dizisi: DNA dizileme tarihi. Genomik, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK ve Mardis, ER (2013). Yeni nesil dizileme devrimi ve genomik üzerindeki etkisi. Celi, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Bilimsel rekabetler. Galileo'dan insan genom projesine. Editoryal Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S. ve Coulson, AR (1977). Zincir sonlandırıcı inhibitörlerle DNA dizilimi. Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Yeni nesil dizileme, günümüz biyolojisini dönüştürüyor. Doğa yöntemleri, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Yeni nesil sıralama. Caister Academic Press.